豬TRIM11基因克隆及其對(duì)豬偽狂犬病毒增殖影響的研究.pdf

1、TRIM蛋白是以三基序結(jié)構(gòu)(也叫做RBCC結(jié)構(gòu)域)為特點(diǎn)的蛋白家族，TRIM蛋白參與了各種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞增殖，分化，癌癥發(fā)生以及凋亡等。許多TRIM蛋白可以作為固有免疫的組分或直接與病毒組分作用調(diào)控病毒的感染過程。TRIM11是TRIM蛋白家族的一員，對(duì)于人TRIM11的研究發(fā)現(xiàn)TRIM11可以抑制HIV-1的侵入，復(fù)制與釋放，發(fā)揮抗病毒作用，又可以負(fù)調(diào)控IRF3的激活促進(jìn)HSV-1的感染，可見TRIM11在病毒感染過程中有著復(fù)雜的

2、調(diào)節(jié)作用。目前關(guān)于豬TRIM11基因的研究很少，本文構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)豬TRIM11的PK15細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究豬TRIM11的生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。
　　為了研究豬TRIM11對(duì)偽狂犬病毒感染的作用，本研究從豬頜下淋巴結(jié)cDNA中擴(kuò)增出豬TRIM11編碼序列，對(duì)TRIM11基因進(jìn)行分析，進(jìn)行了組織表達(dá)譜分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建真核表達(dá)載體PB-TRIM11并將重組載體轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，通過嘌呤霉素篩選

3、及qRT-PCR鑒定獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。用0.1MOI PRV感染過表達(dá)TRIM11PK15細(xì)胞和轉(zhuǎn)染PB空載體對(duì)照組細(xì)胞，分別于感染后0h，12h，24h，36h收獲細(xì)胞上清，檢測(cè)PRV的滴度(TCID50)。用0.1MOI PRV感染PK15細(xì)胞，于感染后0h，12h，24h，36h收獲細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA檢測(cè)TRIM11轉(zhuǎn)錄水平的變化。用0.1MOI PRV感染過表達(dá)TRIM11PK15細(xì)胞和轉(zhuǎn)染PB空載體對(duì)照組細(xì)

4、胞，同時(shí)設(shè)不感染PRV對(duì)照，于感染后12h收獲細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA檢測(cè)IFN-β轉(zhuǎn)錄水平的變化。用IFN-β-Luc轉(zhuǎn)染過表達(dá)TRIM11PK15細(xì)胞和轉(zhuǎn)染PB空載體對(duì)照組細(xì)胞，之后兩組細(xì)胞接種0.1MOI PRV，同時(shí)設(shè)不接種病毒對(duì)照組，于感染后12h收獲細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)IFN-β啟動(dòng)子活性的變化。
　　結(jié)果表明，豬TRIM11的ORF長(zhǎng)度為1407bp，編碼468個(gè)氨基酸，蛋白分子量53kDa，等

5、電點(diǎn)為5.409，其蛋白有3個(gè)TRIM家族保守的結(jié)構(gòu)域，這三個(gè)結(jié)構(gòu)域從N端到C端的順序依次是RING結(jié)構(gòu)、2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域、一個(gè)卷曲結(jié)構(gòu)域(Coiled-coil domain)。此外該蛋白C端結(jié)構(gòu)域?yàn)樽畛Ｒ姷腜RY結(jié)構(gòu)域和SPRY結(jié)構(gòu)域。組織表達(dá)譜分析的結(jié)果顯示，豬TRIM11基因在脂肪組織、肺的表達(dá)量較高，而在心臟，回腸，十二指腸，直腸中的表達(dá)量較低?；驕y(cè)序結(jié)果顯示克隆的豬TRIM11cDNA序列正確并成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體P

6、B-TRIM11，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明TRIM11在PK15細(xì)胞系中成功表達(dá)。檢測(cè)感染PRV后過表達(dá)TRIM11PK15細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞上清液病毒的TCID50發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TRIM11組的病毒滴度始終高于對(duì)照組，這種差異在12h時(shí)更明顯(P＜0.05)。提示，過表達(dá)TRIM11促進(jìn)了PRV的增殖，這種作用在PRV感染早期更顯著。PRV感染可以抑制PK15細(xì)胞中TRIM11的轉(zhuǎn)錄水平。TRIM11過表達(dá)促進(jìn)了PRV感染過程中PK15細(xì)