氧自由基-線粒體信號(hào)通路與腦創(chuàng)傷神經(jīng)細(xì)胞死亡以及Edaravone的治療作用機(jī)制研究.pdf

1、我室的前期工作已證實(shí)TBI后氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。然而該過程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并不清楚。為了尋求通路上的關(guān)鍵點(diǎn)，并以此找到治療新措施，本課題繼續(xù)探索這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 目的： 探討腦創(chuàng)傷后在抗氧化劑Edaravone干預(yù)下大鼠大腦皮質(zhì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及大鼠行為學(xué)改變情況，證明腦創(chuàng)傷后氧化應(yīng)激誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路和Edaravone對(duì)腦保護(hù)作用的可能機(jī)制，以期為臨床治療提供理論依據(jù)和開拓新的治療前景。

2、方法： 雄性成年SD大鼠180只，體重300-350 g，隨機(jī)分組，分為顱腦創(chuàng)傷組、Edaravone治療組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。每組設(shè)傷后1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)6個(gè)時(shí)相點(diǎn)。治療組給予Edaravone10mg/kg，對(duì)照組、顱腦創(chuàng)傷(TBI)組給予等量生理鹽水。注射方法為傷后10分鐘尾靜脈注射，每24小時(shí)注射1次。采用改進(jìn)的Marmarou’s法建立大鼠中度閉合性彌漫性顱腦損傷模型，大鼠在各自時(shí)間點(diǎn)處死；

3、HE染色觀察大鼠顱腦損傷后皮層神經(jīng)元的病理改變；免疫組化法和TUNEL法以及硫代巴比妥酸縮合法觀察不同時(shí)相點(diǎn)大鼠皮層Cyt-c、Bcl-2和Bax的表達(dá)情況，細(xì)胞凋亡和MDA變化情況以及Edaravone的干預(yù)下大鼠行為學(xué)改變；陽性細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)弱采用Motic Med 6.0計(jì)算機(jī)真彩色圖象分析系統(tǒng)以平均光密度進(jìn)行半定量分析；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.5 forwindows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果： 大鼠致傷后多數(shù)

4、短暫呈去大腦狀態(tài)及呼吸抑制。多數(shù)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔可見出血或黃染，頂葉打擊區(qū)有散在的腦挫裂傷，腦實(shí)質(zhì)內(nèi)部散在血腫。HE染色可見創(chuàng)傷后6小時(shí)大腦皮質(zhì)出現(xiàn)散在變性壞死神經(jīng)元，傷后24h達(dá)高峰。上述結(jié)果與Mamarou所描述的模型傷后表現(xiàn)大致相符。 自由基中間產(chǎn)物丙二醛(MDA)測定結(jié)果：傷后6小時(shí)即可檢測到MDA的升高，與對(duì)照組相比，24小時(shí)顯著升高48h達(dá)高峰(p<0.01)，與創(chuàng)傷組相比較治療組MDA含量各時(shí)相點(diǎn)均有所降低，其中以2

5、4h、48h和72h有顯著性差異(p<0.01)。 與對(duì)照組相比，創(chuàng)傷組Cytc陽性細(xì)胞免疫反應(yīng)6h增強(qiáng)，24h達(dá)高峰，在3h、6h、24h、48h和72h有顯著性差異(p<0.01)。與創(chuàng)傷組相比Edaravone治療組Ctyc陽性細(xì)胞免疫反應(yīng)在24h、48h和72h明顯降低(p<0.01)。 Bcl-2表達(dá)在傷后應(yīng)激性增高，于3h達(dá)高峰，以后逐漸下降，Bax在傷后表達(dá)逐漸增高，于48h達(dá)高峰，Bax/Bcl-2于48

6、 h達(dá)高峰。Edaravone能顯著改善二者的比例變化，與創(chuàng)傷組比較在24h、48h、72 h差異具有顯著性(p<0.01)。 腦創(chuàng)傷后，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，24小時(shí)以前以TUNEL Ⅰ型細(xì)胞為主，24小時(shí)后TUNEL陽性細(xì)胞以Ⅱ型細(xì)胞為主并于48h達(dá)高峰。Edaravone明顯降低腦創(chuàng)傷后大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)，與創(chuàng)傷組比較在24h、48h、72h有顯著性差異(p<0.01)。 傷后1小時(shí)至24小時(shí)丙

7、二醛(MDA)與Cytc免疫反應(yīng)密切相關(guān)(r=0.997，p<0.01)；傷后1小時(shí)至72小時(shí)丙二醛(MDA)與TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)密切相關(guān)(r=0.921，p<0.01)；傷后1小時(shí)至24小時(shí)Cytc與TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)密切相關(guān)(r=0.958，p<0.05)：傷后1小時(shí)至24小時(shí)Bax和Bcl-2二者的比例與Cytc免疫反應(yīng)相關(guān)(r=0.996，p<0.01)，但Cytc表達(dá)峰值(24h)早于Bax和Bcl-2二者的比例高峰值(4

8、8h)；傷后1小時(shí)至72小時(shí)Bax和Bcl-2二者的比例與TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)密切相關(guān)(r=0.925，p<0.01)。行為學(xué)分析：Edaravone能改善TBI后72h的神經(jīng)生理功能的缺陷程度(p<0.01)。 結(jié)論： 1.大鼠TBI后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞死亡存在壞死和凋亡兩種方式，其中以凋亡為主。 2.氧自由基-線粒體-Cytc是腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一條。腦創(chuàng)傷導(dǎo)致大量自由基產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體滲透

9、性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，PTP)開放，使Cytc釋出，經(jīng)過下游的Bcl-2、Bax等蛋白表達(dá)的調(diào)整，導(dǎo)致大腦皮層神經(jīng)元發(fā)生凋亡。 3.氧自由基、Bcl-2、Bax三因素在細(xì)胞色素c釋放的調(diào)節(jié)中，氧自由基可能是細(xì)胞色素C釋放的主要因素，Bax和Bcl-2二者的比例對(duì)Ctyc釋放的調(diào)節(jié)起重要作用，Bax和Bcl-2二者的比例在Ctyc釋放后的凋亡基因的調(diào)節(jié)中可