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文檔簡介
1、目的:探討TBI后ERK1/2參與細(xì)胞凋亡通路的機制,檢測并分析TBI、TBI+U0126干預(yù)組中P53、Cytc、AIF等指標(biāo)表達(dá)變化,從線粒體.細(xì)胞凋亡通路上探討TBI后ERK1/2活化誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的分子機制,為臨床上的早期干預(yù)和控制開拓新思路。
方法:采用Marmarou方法,按照DeMudler分級標(biāo)準(zhǔn),用重450g、直徑18mm的銅棒從1.2m高度自由落下?lián)糁写笫箢^部,造成大鼠中度彌漫性顱腦創(chuàng)傷。
2、 實驗動物及分組:SD雄性大鼠237只,體重300-350g,隨機分成4組:假手術(shù)組(實驗對照組,n=42只);創(chuàng)傷組(模型組,n=65);U0126干預(yù)組(n=65),溶劑DMSO對照組(n=65只)。每組劃分為傷后30min、3h、12h、24h、48h、72h、7d等7個時相點。
檢測指標(biāo)及方法:①神經(jīng)運動功能損害評分;②HE染色觀察一般組織結(jié)構(gòu);⑧免疫組織化學(xué)方法檢測P53、Cytc、AIF、p-ERK1/2的蛋
3、白表達(dá)及組織細(xì)胞定位;④硝酸還原酶法測定NO含量;⑤Western-blot法檢測p-ERK1/2蛋白表達(dá)量;⑥原位細(xì)胞DNA斷裂檢測(TUNEL)法檢測細(xì)胞凋亡動態(tài)變化。
另取40只大鼠隨機分為腦創(chuàng)傷組、U0126組、假手術(shù)組,溶劑DMSO對照組,每組10只,進行Morris水迷宮檢測大鼠傷后學(xué)習(xí)記憶功能。
定量測定:免疫組化陽性細(xì)胞陽性度強弱用Image Proplus6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)定量分析測
4、定,以平均光密度(IOD/Area值)來表示;Western blot蛋白定量分析用Gel-Doc凝膠成像分析系統(tǒng)定量分析測定,以目標(biāo)平均灰度值與內(nèi)參平均灰度值的比值來表示。
統(tǒng)計學(xué)分析:實驗中所得數(shù)據(jù)均用x±s表示,用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析、Pearson方法兩兩相關(guān)分析,以單側(cè)P<0.05,表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:
1.形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果
大鼠致傷后多數(shù)呈
5、短暫去大腦狀態(tài)及呼吸抑制。HE染色光鏡結(jié)果:假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)正常,蛛網(wǎng)膜下腔、腦室無出血,血管管腔正常,管壁光滑,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量多,形態(tài)完整;創(chuàng)傷組蛛網(wǎng)膜下腔可見出血或黃染,大腦皮層組織廣泛水腫,血管腔擴大、充血,傷后3h和72h神經(jīng)細(xì)胞變性、腫脹、壞死顯著。上述觀察結(jié)果與Marmarou所描述的彌漫性腦創(chuàng)傷的病理形態(tài)特征相符。給予U0126干預(yù)組病理形態(tài)改變較創(chuàng)傷組有不同程度減輕(Fig.11-1,2)。
2.神經(jīng)功能評
6、分結(jié)果
假手術(shù)組大鼠神經(jīng)運動功能評分為24分;創(chuàng)傷組大鼠神經(jīng)功能評分在7-9分之間;U0126干預(yù)組神經(jīng)功能評分15-18分之間。與假手術(shù)組比較,在創(chuàng)傷組和U0126干預(yù)組中,大鼠在后肢抓持反射、觸須誘發(fā)前肢定位及側(cè)向墊步試驗中均表現(xiàn)異常,評分下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);創(chuàng)傷組與DMSO組比較,無顯著差異(P>0.05);U0126干預(yù)組與創(chuàng)傷組比較,神經(jīng)功能評分提高(P<0.05)(Tablel-1,F(xiàn)ig.
7、9)。
3.NO測定結(jié)果
假手術(shù)組:可檢測到少量NO,NO量不隨時間發(fā)生顯著變化;腦創(chuàng)傷組30min即可見NO含量迅速升高,于24h達(dá)高峰,持續(xù)高表達(dá)至72h,但仍較假手術(shù)組為高,經(jīng)圖像分析,腦創(chuàng)傷組與假手術(shù)組相比,以30min、3h、12h、24h、48h、72h差異顯著(P<0.05);創(chuàng)傷組與DMSO組比較,無顯著差異(P>0.05);U0126組與腦創(chuàng)傷組比較,各時相點NO量均有不同程度減少,以30m
8、in、3h、12h、24h、48h、72h差異顯著(P<0.05)(Table6;Fig.6-1,2)。
4.Cytc免疫組化檢測結(jié)果
Cytc產(chǎn)物為棕黃色顆粒,定位于神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)。假手術(shù)組偶見陽性細(xì)胞,著色淺淡,免疫反應(yīng)性不隨時間發(fā)生變化。創(chuàng)傷組與假手術(shù)組比較,傷后3h Ctyc陽性細(xì)胞顯著增多,著色加深,免疫反應(yīng)性增強(P<0.05),隨時間推移陽性細(xì)胞逐漸增多,免疫反應(yīng)性逐漸增強,傷后48h達(dá)高峰(P
9、<0.05),72h迅速下降,但仍高于假手術(shù)組(P<0.05);U0126干預(yù)組Ctyc免疫陽性反應(yīng)性時程與創(chuàng)傷組相似,但免疫反應(yīng)性減弱,以24h和48h差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(Table3;Fig.3-1,2)。
5.P53免疫組化檢測結(jié)果
P53陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒,定位于神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)或胞核與假手術(shù)組比較,腦創(chuàng)傷后3h皮質(zhì)出現(xiàn)P53蛋白表達(dá),12h明顯增強((P<0.05),24h(P<0.05
10、)、48h達(dá)高峰(P<0.05),72h有所下降,于傷后7d不能檢測得到p53蛋白的免疫反應(yīng),鏡下觀察可見陽性細(xì)胞呈棕黃色;DMSO組無顯著差異(P>0.05);U0126組與創(chuàng)傷組、DMSO組相比,有顯著性差異(P<0.05)(Table1-2;Fig.1-1,2)。
6.AIF免疫組化檢測結(jié)果
AIF陽性細(xì)胞核呈棕黃色,假手術(shù)組大鼠腦組織中僅見少量AIF陽性細(xì)胞,與假手術(shù)組比,創(chuàng)傷組3h AIF陽性細(xì)胞
11、明顯增加,24h達(dá)高峰,48h有所下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);DMSO組與創(chuàng)傷組相比無顯著差異(P>0.05);U0126干預(yù)組在3h,24h,48h三個時間點的表達(dá)均低于腦創(chuàng)傷組(P<0.05)(Table4;Fig.4-1,2)。
7.P-ERK1/2免疫組化及Western blot檢測結(jié)果
P-ERK1/2產(chǎn)物為棕黃色顆粒,主要定位于神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)。假手術(shù)組未見p-ERK1/2陽性細(xì)胞;創(chuàng)傷
12、組與假手術(shù)組比較,傷后30min p-ERK1/2陽性細(xì)胞顯著增多,免疫反應(yīng)性增強,以后逐漸增多,傷后24h p-ERK1/2陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)高峰(P<0.05),72h有所減少;U0126干預(yù)組p-ERK1/2免疫陽性反應(yīng)性時程與創(chuàng)傷組相似,但免疫反應(yīng)性減弱(P<0.05)(Table2-1;Fig.2-1,2)。Westernblot蛋白結(jié)果顯示:假手術(shù)組p-ERK1/2蛋白表達(dá)量在各時間點無變化;創(chuàng)傷組與假手術(shù)組比較,傷后30minp
13、-ERK1/2蛋白量顯著增高,傷后24h達(dá)高峰(P<0.05),高表達(dá)狀態(tài)持續(xù)至傷后72h(P<0.05),傷后72h迅速下降;U0126干預(yù)組p-ERK1/2蛋白表達(dá)時程與創(chuàng)傷組相似,但表達(dá)量減少,與創(chuàng)傷組比較,以傷后3h、24h和72h差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);DMSO組與創(chuàng)傷組無顯著差異(P>0.05)(Table2-2;Fig.2-3,4;Fig.10)。
8.細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果
TUNEL陽
14、性細(xì)胞呈棕黃色,細(xì)胞胞核著色。假手術(shù)組偶見TUNEL陽性細(xì)胞;創(chuàng)傷組與假手術(shù)組比較,傷后3h TUNEL陽性細(xì)胞開始顯著增加(P<0.05),隨時間推移逐漸增多,傷后72h達(dá)高峰(P<0.05);U0126干預(yù)組TUNEL陽性細(xì)胞在時相與創(chuàng)傷組相似,但TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少,與創(chuàng)傷組比較,以傷后24h、48h和72h差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外,TUNEL陽性細(xì)胞的分布與表達(dá)區(qū)域與相鄰切片上Cytc和p-ERK1/2陽性
15、細(xì)胞呈現(xiàn)很大的重疊性,三者陽性細(xì)胞在形態(tài)上具有很大的相似性(Table5;Fig.5-1,2)。
9.相關(guān)分析結(jié)果
(1)傷后30min至72h,NO量與p-ERK1/2免疫反應(yīng)呈正相關(guān)(r=0.904,P<0.01)(Fig.8-1);(2)傷后30min至72h,NO量與U0126作用呈正相關(guān)(Fig.8-2);(2)傷后30min至72h,p-ERK1/2蛋白表達(dá)量與p53(r=0.831,P<0.01
16、)(Fig.8-3),Cytc(r=0.845,P<0.01)和AIF(r=0.846,P<0.01)表達(dá)呈正相關(guān);Cytc(r=0.954,P<0.01)(Fig.8-4)和AIF(r=0.957,P<0.01)(Fig.8-5)表達(dá)與p53蛋白量呈正相關(guān);TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)與Cytc表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.559,P<0.01)(Fig.8-6)。
10.Morris水迷宮結(jié)果
為避免大鼠顱腦創(chuàng)傷后運動
17、功能障礙對水迷宮測試結(jié)果的影響,各組分別于傷后7、8、9及第10天進行Morris迷宮測試。結(jié)果表明,創(chuàng)傷組傷后第9天(P<0.01)及第10天(P<0.01)搜索安全島潛伏期較正常組及假手術(shù)組明顯延長。U0126干預(yù)組傷后第9天(P<0.01)及第10天(P<0.01)搜索安全島潛伏期較創(chuàng)傷組明顯縮短(Table7;Fig.17-1,2,3,4)。
結(jié)論:
1.大鼠腦創(chuàng)傷后,神經(jīng)細(xì)胞相繼出現(xiàn)壞死和凋亡,其中
18、以凋亡為主。海馬區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞凋亡增多,是大鼠記憶、學(xué)習(xí)功能受損的主要原因。
2.FBI后腦組織中p-ERK1/2、P53、Cytc and AIF表達(dá)變化參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程。
3.大鼠TBI后腦組織中氧自由基(NO)含量與p-ERK1/2的表達(dá)呈正相關(guān),通過激活ERK1/2信號通路在神經(jīng)凋亡進程中具有重要作用,其通過調(diào)控促凋亡蛋白P53表達(dá),進而參與線粒體Cytc-細(xì)胞凋亡級聯(lián)通路。
4.
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