大鼠腦創(chuàng)傷后ERK1-2信號通路介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的分子機制研究.pdf

1、目的：探討TBI后ERK1/2參與細(xì)胞凋亡通路的機制，檢測并分析TBI、TBI+U0126干預(yù)組中P53、Cytc、AIF等指標(biāo)表達(dá)變化，從線粒體.細(xì)胞凋亡通路上探討TBI后ERK1/2活化誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的分子機制，為臨床上的早期干預(yù)和控制開拓新思路。
　　 方法：采用Marmarou方法，按照DeMudler分級標(biāo)準(zhǔn)，用重450g、直徑18mm的銅棒從1.2m高度自由落下?lián)糁写笫箢^部，造成大鼠中度彌漫性顱腦創(chuàng)傷。
　　

2、 實驗動物及分組：SD雄性大鼠237只，體重300-350g，隨機分成4組：假手術(shù)組（實驗對照組，n=42只）；創(chuàng)傷組（模型組，n=65）；U0126干預(yù)組（n=65），溶劑DMSO對照組（n=65只）。每組劃分為傷后30min、3h、12h、24h、48h、72h、7d等7個時相點。
　　 檢測指標(biāo)及方法：①神經(jīng)運動功能損害評分；②HE染色觀察一般組織結(jié)構(gòu)；⑧免疫組織化學(xué)方法檢測P53、Cytc、AIF、p-ERK1/2的蛋

3、白表達(dá)及組織細(xì)胞定位；④硝酸還原酶法測定NO含量；⑤Western-blot法檢測p-ERK1/2蛋白表達(dá)量；⑥原位細(xì)胞DNA斷裂檢測（TUNEL）法檢測細(xì)胞凋亡動態(tài)變化。
　　 另取40只大鼠隨機分為腦創(chuàng)傷組、U0126組、假手術(shù)組，溶劑DMSO對照組，每組10只，進行Morris水迷宮檢測大鼠傷后學(xué)習(xí)記憶功能。
　　 定量測定：免疫組化陽性細(xì)胞陽性度強弱用Image Proplus6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)定量分析測

4、定，以平均光密度（IOD/Area值）來表示；Western blot蛋白定量分析用Gel-Doc凝膠成像分析系統(tǒng)定量分析測定，以目標(biāo)平均灰度值與內(nèi)參平均灰度值的比值來表示。
　　 統(tǒng)計學(xué)分析：實驗中所得數(shù)據(jù)均用x±s表示，用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析、Pearson方法兩兩相關(guān)分析，以單側(cè)P<0.05，表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果
　　 大鼠致傷后多數(shù)呈

5、短暫去大腦狀態(tài)及呼吸抑制。HE染色光鏡結(jié)果：假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)正常，蛛網(wǎng)膜下腔、腦室無出血，血管管腔正常，管壁光滑，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量多，形態(tài)完整；創(chuàng)傷組蛛網(wǎng)膜下腔可見出血或黃染，大腦皮層組織廣泛水腫，血管腔擴大、充血，傷后3h和72h神經(jīng)細(xì)胞變性、腫脹、壞死顯著。上述觀察結(jié)果與Marmarou所描述的彌漫性腦創(chuàng)傷的病理形態(tài)特征相符。給予U0126干預(yù)組病理形態(tài)改變較創(chuàng)傷組有不同程度減輕（Fig.11-1，2）。
　　 2.神經(jīng)功能評

6、分結(jié)果
　　 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)運動功能評分為24分；創(chuàng)傷組大鼠神經(jīng)功能評分在7-9分之間；U0126干預(yù)組神經(jīng)功能評分15-18分之間。與假手術(shù)組比較，在創(chuàng)傷組和U0126干預(yù)組中，大鼠在后肢抓持反射、觸須誘發(fā)前肢定位及側(cè)向墊步試驗中均表現(xiàn)異常，評分下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；創(chuàng)傷組與DMSO組比較，無顯著差異（P>0.05）；U0126干預(yù)組與創(chuàng)傷組比較，神經(jīng)功能評分提高（P<0.05）（Tablel-1，F(xiàn)ig.

7、9）。
　　 3.NO測定結(jié)果
　　 假手術(shù)組：可檢測到少量NO，NO量不隨時間發(fā)生顯著變化；腦創(chuàng)傷組30min即可見NO含量迅速升高，于24h達(dá)高峰，持續(xù)高表達(dá)至72h，但仍較假手術(shù)組為高，經(jīng)圖像分析，腦創(chuàng)傷組與假手術(shù)組相比，以30min、3h、12h、24h、48h、72h差異顯著（P<0.05）；創(chuàng)傷組與DMSO組比較，無顯著差異（P>0.05）；U0126組與腦創(chuàng)傷組比較，各時相點NO量均有不同程度減少，以30m

8、in、3h、12h、24h、48h、72h差異顯著（P<0.05）（Table6；Fig.6-1，2）。
　　 4.Cytc免疫組化檢測結(jié)果
　　 Cytc產(chǎn)物為棕黃色顆粒，定位于神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)。假手術(shù)組偶見陽性細(xì)胞，著色淺淡，免疫反應(yīng)性不隨時間發(fā)生變化。創(chuàng)傷組與假手術(shù)組比較，傷后3h Ctyc陽性細(xì)胞顯著增多，著色加深，免疫反應(yīng)性增強（P<0.05），隨時間推移陽性細(xì)胞逐漸增多，免疫反應(yīng)性逐漸增強，傷后48h達(dá)高峰（P

9、<0.05），72h迅速下降，但仍高于假手術(shù)組（P<0.05）；U0126干預(yù)組Ctyc免疫陽性反應(yīng)性時程與創(chuàng)傷組相似，但免疫反應(yīng)性減弱，以24h和48h差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（Table3；Fig.3-1，2）。
　　 5.P53免疫組化檢測結(jié)果
　　 P53陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，定位于神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)或胞核與假手術(shù)組比較，腦創(chuàng)傷后3h皮質(zhì)出現(xiàn)P53蛋白表達(dá)，12h明顯增強（（P<0.05），24h（P<0.05

10、）、48h達(dá)高峰（P<0.05），72h有所下降，于傷后7d不能檢測得到p53蛋白的免疫反應(yīng)，鏡下觀察可見陽性細(xì)胞呈棕黃色；DMSO組無顯著差異（P>0.05）；U0126組與創(chuàng)傷組、DMSO組相比，有顯著性差異（P<0.05）（Table1-2；Fig.1-1，2）。
　　 6.AIF免疫組化檢測結(jié)果
　　 AIF陽性細(xì)胞核呈棕黃色，假手術(shù)組大鼠腦組織中僅見少量AIF陽性細(xì)胞，與假手術(shù)組比，創(chuàng)傷組3h AIF陽性細(xì)胞

11、明顯增加，24h達(dá)高峰，48h有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；DMSO組與創(chuàng)傷組相比無顯著差異（P>0.05）；U0126干預(yù)組在3h，24h，48h三個時間點的表達(dá)均低于腦創(chuàng)傷組（P<0.05）（Table4；Fig.4-1，2）。
　　 7.P-ERK1/2免疫組化及Western blot檢測結(jié)果
　　 P-ERK1/2產(chǎn)物為棕黃色顆粒，主要定位于神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)。假手術(shù)組未見p-ERK1/2陽性細(xì)胞；創(chuàng)傷

12、組與假手術(shù)組比較，傷后30min p-ERK1/2陽性細(xì)胞顯著增多，免疫反應(yīng)性增強，以后逐漸增多，傷后24h p-ERK1/2陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)高峰（P<0.05），72h有所減少；U0126干預(yù)組p-ERK1/2免疫陽性反應(yīng)性時程與創(chuàng)傷組相似，但免疫反應(yīng)性減弱（P<0.05）（Table2-1；Fig.2-1，2）。Westernblot蛋白結(jié)果顯示：假手術(shù)組p-ERK1/2蛋白表達(dá)量在各時間點無變化；創(chuàng)傷組與假手術(shù)組比較，傷后30minp

13、-ERK1/2蛋白量顯著增高，傷后24h達(dá)高峰（P<0.05），高表達(dá)狀態(tài)持續(xù)至傷后72h（P<0.05），傷后72h迅速下降；U0126干預(yù)組p-ERK1/2蛋白表達(dá)時程與創(chuàng)傷組相似，但表達(dá)量減少，與創(chuàng)傷組比較，以傷后3h、24h和72h差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；DMSO組與創(chuàng)傷組無顯著差異（P>0.05）（Table2-2；Fig.2-3，4；Fig.10）。
　　 8.細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果
　　 TUNEL陽

14、性細(xì)胞呈棕黃色，細(xì)胞胞核著色。假手術(shù)組偶見TUNEL陽性細(xì)胞；創(chuàng)傷組與假手術(shù)組比較，傷后3h TUNEL陽性細(xì)胞開始顯著增加（P<0.05），隨時間推移逐漸增多，傷后72h達(dá)高峰（P<0.05）；U0126干預(yù)組TUNEL陽性細(xì)胞在時相與創(chuàng)傷組相似，但TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，與創(chuàng)傷組比較，以傷后24h、48h和72h差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。此外，TUNEL陽性細(xì)胞的分布與表達(dá)區(qū)域與相鄰切片上Cytc和p-ERK1/2陽性

15、細(xì)胞呈現(xiàn)很大的重疊性，三者陽性細(xì)胞在形態(tài)上具有很大的相似性（Table5；Fig.5-1，2）。
　　 9.相關(guān)分析結(jié)果
　　 （1）傷后30min至72h，NO量與p-ERK1/2免疫反應(yīng)呈正相關(guān)（r=0.904，P<0.01）（Fig.8-1）；（2）傷后30min至72h，NO量與U0126作用呈正相關(guān)（Fig.8-2）；（2）傷后30min至72h，p-ERK1/2蛋白表達(dá)量與p53（r=0.831，P<0.01

16、）（Fig.8-3），Cytc（r=0.845，P<0.01）和AIF（r=0.846，P<0.01）表達(dá)呈正相關(guān)；Cytc（r=0.954，P<0.01）（Fig.8-4）和AIF（r=0.957，P<0.01）（Fig.8-5）表達(dá)與p53蛋白量呈正相關(guān)；TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)與Cytc表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.559，P<0.01）（Fig.8-6）。
　　 10.Morris水迷宮結(jié)果
　　 為避免大鼠顱腦創(chuàng)傷后運動

17、功能障礙對水迷宮測試結(jié)果的影響，各組分別于傷后7、8、9及第10天進行Morris迷宮測試。結(jié)果表明，創(chuàng)傷組傷后第9天（P<0.01）及第10天（P<0.01）搜索安全島潛伏期較正常組及假手術(shù)組明顯延長。U0126干預(yù)組傷后第9天（P<0.01）及第10天（P<0.01）搜索安全島潛伏期較創(chuàng)傷組明顯縮短（Table7；Fig.17-1，2，3，4）。
　　 結(jié)論：
　　 1.大鼠腦創(chuàng)傷后，神經(jīng)細(xì)胞相繼出現(xiàn)壞死和凋亡，其中

18、以凋亡為主。海馬區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞凋亡增多，是大鼠記憶、學(xué)習(xí)功能受損的主要原因。
　　 2.FBI后腦組織中p-ERK1/2、P53、Cytc and AIF表達(dá)變化參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程。
　　 3.大鼠TBI后腦組織中氧自由基（NO）含量與p-ERK1/2的表達(dá)呈正相關(guān)，通過激活ERK1/2信號通路在神經(jīng)凋亡進程中具有重要作用，其通過調(diào)控促凋亡蛋白P53表達(dá)，進而參與線粒體Cytc-細(xì)胞凋亡級聯(lián)通路。
　　 4.