鎘誘發(fā)自噬和mTOR通路激活在神經(jīng)細胞死亡中作用及機理研究.pdf

1、本研究運用細胞培養(yǎng)、激光共聚焦、透射電鏡、Western blotting等細胞分子生物學技術(shù)，研究了鎘誘發(fā)神經(jīng)細胞凋亡過程中，自噬通路參與機制，初步探討加入3-MA和/或雷帕霉素對鎘誘導自噬的影響以及與鎘激活mTOR通路誘發(fā)神經(jīng)細胞凋亡的關系，并觀察了鎘誘發(fā)神經(jīng)細胞自噬與Akt/mTOR通路激活和胞內(nèi)Ca2+([Ca2+]i)升高的關系。具體結(jié)果如下：
　　1.鎘誘導神經(jīng)細胞自噬與mTOR通路激活的關系及其在細胞凋亡中的作用

2、r>　　PC12細胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板中，以不同濃度鎘(0、2.5、5、10和20μM)和0.1％血清饑餓處理神經(jīng)細胞12 h，或用20μM鎘處理神經(jīng)細胞為0-24 h，或用3-MA和/或雷帕霉素(Rap)預處理神經(jīng)細胞后暴露鎘(10和20μM)12 h。采用透射電鏡、激光共聚焦法、形態(tài)學觀察等方法分析鎘誘發(fā)的神經(jīng)細胞自噬表現(xiàn)及其凋亡的關系；Western blot分析Akt/mTOR通路和LC23Ⅰ/Ⅱ蛋白變化。結(jié)果顯示，10和20

3、μM鎘處理PC12細胞12 h誘導自噬體發(fā)生；鎘激活自噬關聯(lián)神經(jīng)細胞凋亡，這被鎘以濃度和時間依賴的方式誘發(fā)神經(jīng)細胞LC3-Ⅱ增加，以及3-MA預處理部分地抑制鎘誘導的LC3-Ⅱ表達和營救神經(jīng)細胞凋亡證據(jù)支持；鎘激活自噬和激活mTOR通路可能為相伴并行共同參與神經(jīng)細胞凋亡。提示：鎘誘導神經(jīng)細胞自噬與mTOR通路激活相伴并行在神經(jīng)細胞凋亡中發(fā)揮作用。
　　2.鈣離子在鎘誘導神經(jīng)細胞自噬和mTOR通路激活中作用及機理
　　PC12

4、細胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板在37℃，含5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第2天，用20μM BAPTA/AM、100μM EGTA、100μM2-APB或10μM KN93預處理1 h后暴露鎘(10和20μM)12 h。Western blot分析LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白變化和Akt、S6K1、4E-BP1蛋白磷酸化表現(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)，BAPTA/AM、EGTA和2-APB抑制鎘誘導神經(jīng)細胞LC3-Ⅱ表達和Akt和mTOR介導的S6K1和4E-BP1蛋白磷酸化增