大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的研究.pdf

1、目前對于終末期肝病和部分遺傳性肝病缺乏理想的治療措施，以補(bǔ)充功能性肝細(xì)胞為思路的細(xì)胞治療和生物人工肝即是一個大膽、有益的嘗試。但因肝細(xì)胞不能取材于自體，且同種肝細(xì)胞數(shù)量和保存時(shí)間有限，使其臨床應(yīng)用受到限制。因此，必需尋找其他來源細(xì)胞替代肝細(xì)胞，成體干細(xì)胞多向分化潛能的發(fā)現(xiàn)給人們帶來了新的希望。成體干細(xì)胞中以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）和臍血間充質(zhì)干細(xì)

2、胞（umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCBMSCs）向肝細(xì)胞分化報(bào)道較多。自2001年Zuk等人[1]發(fā)現(xiàn)人脂肪組織中存在具有多向分化潛能的干細(xì)胞以來，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs）以其來源廣泛、取材方便、自體取材創(chuàng)傷小等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)而很快成為人們的研究熱點(diǎn)。研究表明ADMSC

3、s在適當(dāng)條件下可以向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等方向誘導(dǎo)分化，而向肝細(xì)胞方向分化報(bào)道較少。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化潛能的研究將有望為肝病的細(xì)胞治療和生物人工肝提供大量新的、很有前景的細(xì)胞來源。
　　本研究旨在通過體內(nèi)外不同誘導(dǎo)途徑探討ADMSCs向肝細(xì)胞分化的潛能。首先獲取大鼠脂肪組織，用膠原酶消化法分離出干細(xì)胞，并進(jìn)行體外擴(kuò)增、傳代；用免疫熒光染色法檢測其表面標(biāo)志，并誘導(dǎo)ADMSCs向脂肪細(xì)胞、

4、成骨細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等方向分化，以鑒定所獲取的細(xì)胞是否為間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　用成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor,FGF-4）和肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF）誘導(dǎo)其向肝細(xì)胞分化；倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，誘導(dǎo)后14天和21天分別用免疫熒光檢測法檢測肝細(xì)胞標(biāo)志物白蛋白的表達(dá)，用尿素氮測試盒檢測培養(yǎng)上清液尿素氮含量。通過以上指標(biāo)的測定，研究ADMSCs在

5、體外誘導(dǎo)條件下向肝細(xì)胞分化的能力。
　　隨后我們以同樣的方法從大鼠脂肪組織中分離出干細(xì)胞，并進(jìn)行體外擴(kuò)增、傳代，取第2代ADMSCs用PKH26標(biāo)記，制作部分肝切除模型，將標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)門靜脈自體植入體內(nèi)。2周后切下肝臟制成冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記細(xì)胞在肝臟中的定位，免疫熒光染色檢測標(biāo)記細(xì)胞白蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果表明，從脂肪組織所獲取的細(xì)胞經(jīng)免疫熒光檢測顯示其表面分子CD29（+），而CD31和CD45均為陰性，通過不同

6、的誘導(dǎo)方法細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等方向分化，證實(shí)我們從脂肪組織獲取的細(xì)胞為具有多向分化潛能的干細(xì)胞；誘導(dǎo)14天后可逐漸觀察到肝細(xì)胞樣形態(tài)改變；免疫熒光檢測到白蛋白表達(dá)；尿素氮檢測顯示誘導(dǎo)組尿素氮含量隨時(shí)間延長而逐漸升高。從脂肪組織中分離出的ADMSCs能在體外大量擴(kuò)增，PKH26標(biāo)記后該細(xì)胞在熒光顯微鏡下發(fā)紅色熒光，細(xì)胞標(biāo)記率約95％；熒光顯微鏡下可見肝臟冰凍切片中散在分布紅色標(biāo)記細(xì)胞，免疫熒光染色顯示大多數(shù)標(biāo)

7、記細(xì)胞白蛋白染色陽性。
　　綜上所述，通過我們的實(shí)驗(yàn)方法，可以從大鼠脂肪組織中獲取具有多向分化潛能的干細(xì)胞，即脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADMSC），該細(xì)胞能在體外被誘導(dǎo)分化成形態(tài)、表型及功能與肝細(xì)胞相似的細(xì)胞；體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)顯示，ADMSCs也能在部分肝切除后的肝再生環(huán)境中向肝細(xì)胞分化，有可能在肝部分切除后參與肝再生。
　　本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明ADMSCs在適當(dāng)條件可以被誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞，為ADMSCs在肝病的細(xì)胞治療、生物人工