骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為具有起搏功能的心肌樣細(xì)胞.pdf

1、背景及目的：
　　 病態(tài)竇房結(jié)綜合癥是由于竇房結(jié)或者其周圍組織的器質(zhì)性病導(dǎo)致竇房結(jié)功能減退、沖動形成障礙，或竇房結(jié)沖動傳導(dǎo)障礙，從而產(chǎn)生多種嚴(yán)重的心律失常，其中絕大部分是致命性的心律失常，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和生命安全。然而，病態(tài)竇房結(jié)綜合癥的發(fā)病機(jī)理尚不十分明確，更無有效的預(yù)防和根治措施。目前主要的治療手段是依靠安置人工電子心臟起搏器。但是，它并不是最理想的治療方法，其局限性包括電池壽命有限、需要永久性植入電極導(dǎo)線，以及對

2、自主神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)缺乏反應(yīng)等。因此，研究病竇綜合癥患者的竇房結(jié)結(jié)構(gòu)及功能，并對病變的竇房結(jié)進(jìn)行修復(fù)，重建具有生理功能的“生物起搏器”，取代電子心臟起搏器治療，成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨髓內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞，易于分離、培養(yǎng)，具有多向分化潛能，可以分化為神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，免疫排斥問題不顯著，可以被用于自體移植，使其成為目前細(xì)胞替代療法研究的熱點(diǎn)。
　　 動物實(shí)驗(yàn)表明，將BMSCs移植到受損的竇

3、房結(jié)區(qū)后可以分化為竇房結(jié)樣細(xì)胞并顯著改善竇房結(jié)的起搏功能，表明了心肌微環(huán)境對BMSCs具有誘導(dǎo)分化作用。本研究通過用不同濃度竇房結(jié)細(xì)胞裂解液體外誘導(dǎo)BMSCs，觀察誘導(dǎo)后的BMSCs表達(dá)cTnI及HCN2的情況及其電生理特性，從細(xì)胞水平上探討竇房結(jié)微環(huán)境對BMSCs分化的誘導(dǎo)作用及其作用的最佳濃度。
　　 材料和方法：
　　 1、取新生SD大鼠的竇房結(jié)組織，用胰蛋白酶消化，并采用速差貼壁法和5-溴脫氧尿嘧啶核苷5-Brd

4、U分離純化乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞，觀察其形態(tài)學(xué)特征和電生理特性。
　　 2、用反復(fù)凍融的方法將體外培養(yǎng)的竇房結(jié)細(xì)胞制備成竇房結(jié)細(xì)胞裂解液。
　　 3、在無菌條件下，采用密度梯度離心法分離成年SD大鼠的BMSCs，隨后分別加入含1倍、2倍、4倍和8倍濃度的竇房結(jié)細(xì)胞裂解液培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，選擇用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的BMSCs為對照組，觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化。
　　 4、通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色法分析誘導(dǎo)后的BMSCs表達(dá)心肌特異

5、性肌鈣蛋白I(cTnI)、超極化激活的環(huán)核酸門控的離子通道蛋白(HCN2)的情況，并利用膜片鉗技術(shù)檢測所誘導(dǎo)的細(xì)胞的電生理特性。
　　 結(jié)果：
　　 1、在培養(yǎng)的竇房結(jié)細(xì)胞中觀察到三種不同形態(tài)的細(xì)胞，即梭形細(xì)胞、三角形細(xì)胞與不規(guī)則形細(xì)胞。其中梭形細(xì)胞所占比例最高，且其形態(tài)結(jié)構(gòu)及電生理特性符合竇房結(jié)起搏細(xì)胞的特點(diǎn)。
　　 2、4周后，各種濃度的竇房結(jié)細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)分化的BMSCs均表達(dá)心肌特異性蛋白cTnI和HCN

6、2，且在一定程度下隨著裂解液濃度的升高，細(xì)胞的分化比例也增高。用膜片鉗技術(shù)檢測誘導(dǎo)后的細(xì)胞，可以檢測到超極化條件下激活的起搏電流。
　　 結(jié)論：
　　 1、采用酶消化法結(jié)合差速貼壁及5-BrdU處理，可以顯著提高竇房結(jié)梭形細(xì)胞的比例，是可靠的竇房結(jié)細(xì)胞的分離純化方法。
　　 2、本研究通過細(xì)胞免疫化學(xué)染色觀察誘導(dǎo)分化的細(xì)胞所表達(dá)的起搏通道蛋白的情況，用膜片鉗技術(shù)測定誘導(dǎo)后細(xì)胞的電生理特性，從蛋白和功能水平上證明了