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文檔簡介
1、背景及目的:
病態(tài)竇房結(jié)綜合癥是由于竇房結(jié)或者其周圍組織的器質(zhì)性病導(dǎo)致竇房結(jié)功能減退、沖動形成障礙,或竇房結(jié)沖動傳導(dǎo)障礙,從而產(chǎn)生多種嚴(yán)重的心律失常,其中絕大部分是致命性的心律失常,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和生命安全。然而,病態(tài)竇房結(jié)綜合癥的發(fā)病機(jī)理尚不十分明確,更無有效的預(yù)防和根治措施。目前主要的治療手段是依靠安置人工電子心臟起搏器。但是,它并不是最理想的治療方法,其局限性包括電池壽命有限、需要永久性植入電極導(dǎo)線,以及對
2、自主神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)缺乏反應(yīng)等。因此,研究病竇綜合癥患者的竇房結(jié)結(jié)構(gòu)及功能,并對病變的竇房結(jié)進(jìn)行修復(fù),重建具有生理功能的“生物起搏器”,取代電子心臟起搏器治療,成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨髓內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞,易于分離、培養(yǎng),具有多向分化潛能,可以分化為神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等,免疫排斥問題不顯著,可以被用于自體移植,使其成為目前細(xì)胞替代療法研究的熱點(diǎn)。
動物實(shí)驗(yàn)表明,將BMSCs移植到受損的竇
3、房結(jié)區(qū)后可以分化為竇房結(jié)樣細(xì)胞并顯著改善竇房結(jié)的起搏功能,表明了心肌微環(huán)境對BMSCs具有誘導(dǎo)分化作用。本研究通過用不同濃度竇房結(jié)細(xì)胞裂解液體外誘導(dǎo)BMSCs,觀察誘導(dǎo)后的BMSCs表達(dá)cTnI及HCN2的情況及其電生理特性,從細(xì)胞水平上探討竇房結(jié)微環(huán)境對BMSCs分化的誘導(dǎo)作用及其作用的最佳濃度。
材料和方法:
1、取新生SD大鼠的竇房結(jié)組織,用胰蛋白酶消化,并采用速差貼壁法和5-溴脫氧尿嘧啶核苷5-Brd
4、U分離純化乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞,觀察其形態(tài)學(xué)特征和電生理特性。
2、用反復(fù)凍融的方法將體外培養(yǎng)的竇房結(jié)細(xì)胞制備成竇房結(jié)細(xì)胞裂解液。
3、在無菌條件下,采用密度梯度離心法分離成年SD大鼠的BMSCs,隨后分別加入含1倍、2倍、4倍和8倍濃度的竇房結(jié)細(xì)胞裂解液培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),選擇用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的BMSCs為對照組,觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化。
4、通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色法分析誘導(dǎo)后的BMSCs表達(dá)心肌特異
5、性肌鈣蛋白I(cTnI)、超極化激活的環(huán)核酸門控的離子通道蛋白(HCN2)的情況,并利用膜片鉗技術(shù)檢測所誘導(dǎo)的細(xì)胞的電生理特性。
結(jié)果:
1、在培養(yǎng)的竇房結(jié)細(xì)胞中觀察到三種不同形態(tài)的細(xì)胞,即梭形細(xì)胞、三角形細(xì)胞與不規(guī)則形細(xì)胞。其中梭形細(xì)胞所占比例最高,且其形態(tài)結(jié)構(gòu)及電生理特性符合竇房結(jié)起搏細(xì)胞的特點(diǎn)。
2、4周后,各種濃度的竇房結(jié)細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)分化的BMSCs均表達(dá)心肌特異性蛋白cTnI和HCN
6、2,且在一定程度下隨著裂解液濃度的升高,細(xì)胞的分化比例也增高。用膜片鉗技術(shù)檢測誘導(dǎo)后的細(xì)胞,可以檢測到超極化條件下激活的起搏電流。
結(jié)論:
1、采用酶消化法結(jié)合差速貼壁及5-BrdU處理,可以顯著提高竇房結(jié)梭形細(xì)胞的比例,是可靠的竇房結(jié)細(xì)胞的分離純化方法。
2、本研究通過細(xì)胞免疫化學(xué)染色觀察誘導(dǎo)分化的細(xì)胞所表達(dá)的起搏通道蛋白的情況,用膜片鉗技術(shù)測定誘導(dǎo)后細(xì)胞的電生理特性,從蛋白和功能水平上證明了
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