大鼠骨髓間充質干細胞轉分化為胰島樣細胞及其保護移植胰島功能的研究.pdf

1、目的：(1)觀察高血糖狀態(tài)下大鼠骨髓中是否存在胰島樣細胞。 (2)建立體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)的方法，確定其生物學特性。 (3)體外誘導BM-MSCs轉分化為胰島樣細胞，評估其生物學功能。 (4)探討B(tài)M-MSCs在糖尿病大鼠體內轉分化為胰島素陽性細胞的潛能。 (5)觀察BM-MSCs對移植胰島功能的保護作用。 方法：(1)分別采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)或高糖誘導S

2、prague-Dawley(SD)大鼠糖尿病動物模型和一過性高血糖狀態(tài)，同齡正常SD大鼠作對照。經密度梯度離心法分離、貼壁法培養(yǎng)原代骨髓細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察胰島相關激素的表達，RT-PCR法檢測胰島相關激素、β細胞標志(GLUT-2、GK、GLP-1R)和轉錄因子(PDX-1、Ngn3、NeuroD1、PAX-6、NKX2.2)基因的表達。流式細胞術檢測胰島相關激素的陽性細胞數(shù)，以及胰島素與CD4

3、5/CD90共表達率，ELISA檢測葡萄糖刺激的胰島素分泌量(GSIS)。 (2)采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法分離、培養(yǎng)SD大鼠BM-MSCs，觀察細胞形態(tài)和超微結構，繪制生長曲線，測定對數(shù)生長期的細胞倍增時間，纖維母細胞集落形成實驗(CFU-F)檢測細胞增殖能力，流式細胞術檢測細胞周期。采用免疫熒光法和流式細胞術檢測細胞表面CD45/CD90、CD45/CD29表達及陽性率。并分別子成骨和成脂誘導分化，VonKossa染色觀

4、察成骨細胞鈣鹽沉積，油紅O染色顯示脂肪細胞脂滴形成。 (3)采用葡萄糖、尼克酰胺和exendin-4體外誘導BM-MSCs轉分化為胰島樣細胞。倒置顯微鏡和電鏡觀察誘導前后細胞形態(tài)和超微結構，雙硫腙染色鑒定胰島樣細胞團，RT-PCR法檢測胰島發(fā)育及其功能相關基因的表達，免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察胰島相關激素的表達。流式細胞術檢測胰島素陽性細胞數(shù)和平均熒光強度，ELISA檢測GSIS。胰島樣細胞門靜脈移植治療STZ誘導的糖尿病大鼠

5、，觀察血糖變化。 (4)予BrdU標記分離培養(yǎng)的SD大鼠BM-MSCs，通過門靜脈和胰腺局部注射法移植治療STZ誘導的糖尿病大鼠，監(jiān)測血糖變化，并通過免疫組織化學法觀察BrdU和胰島素雙陽性細胞的分布。 (5)分離培養(yǎng)SD大鼠BM-MSCs和胰島，予體外混合培養(yǎng)，檢測胰島的存活率和GSIS，評估其功能。然后予BM-MSCs聯(lián)合胰島門靜脈移植治療STZ誘導的糖尿病大鼠，觀察血糖的變化。 結果：(1)原代培養(yǎng)的正常大

6、鼠骨髓細胞可以貼壁生長，單個散在或形成數(shù)個細胞克隆，呈圓形、多角形、長梭形等多種形態(tài)，未檢測到胰島相關激素的基因和蛋白表達。而一過性高血糖組和糖尿病組骨髓細胞可形成細胞團簇，表達胰島素、C肽、胰高血糖素(Gcg)、生長抑素(SS)和胰淀粉樣多肽(IAPP)蛋白，并檢測到相應激素和GLUT-2、GK、GLP-1R及PDX-1、Ngn3、NeuroD1、PAX-6、NKX2.2基因的表達。一過性高血糖恢復組以上基因表達消失。流式細胞術檢測顯

7、示，糖尿病組骨髓胰島素陽性細胞數(shù)為(6.9±2.9)﹪，C肽陽性細胞數(shù)為(6.6±1.3)﹪，Gcg陽性細胞數(shù)為(8.2±0.4)﹪，SS陽性細胞數(shù)為(2.3±1.1)﹪，IAPP陽性細胞數(shù)為(2.3±0.7)﹪。其中，胰島素與CD90的雙陽性細胞數(shù)為5.9﹪,胰島素與CD45的雙陽性細胞數(shù)為1.9﹪。糖尿病組骨髓細胞未檢出葡萄糖刺激的胰島素分泌。(2)BM-MSCs呈長梭形，貼壁生長，在對數(shù)生長期，細胞倍增時間約為59～67小時，細胞

8、周期G0-G1期占(76.8±4.8)﹪，增殖指數(shù)為(23.2±4.8)﹪，CFU-F檢測的集落形成能力為(140±24.2)/104細胞。BM-MSCs細胞表面CD90和CD29的陽性率分別為(96.3±1.7)﹪和(93.9±0.8)﹪，而CD45陽性率僅為(0.3±0.4)﹪。成骨和成脂誘導可以使BM-MSCs出現(xiàn)鈣鹽沉積和脂滴，分化為成骨細胞和脂肪細胞。 (3)BM-MSCs誘導培養(yǎng)過程中，細胞形成團簇狀分布，少數(shù)聚集成

9、團，直徑80～200μm，半懸浮于培養(yǎng)瓶中，雙硫腙染色陽性。電鏡顯示此類細胞胞漿內有較多分泌顆粒。誘導后細胞表達胰島素、Gcg、SS、IAPP、GLUT-2、GK、GLP-1R、PDX-1、Ngn3、NeuroD1、PAX-6、Nkx2.2基因和胰島素、C肽、Gcg、SS、IAPP蛋白。尼克酰胺和exendin-4誘導組胰島素陽性細胞數(shù)約為20﹪，胰島素平均熒光強度增加約2.5倍，可以分泌少量胰島素，葡萄糖刺激的胰島素產量增加約1.5倍

10、，門靜脈移植治療STZ誘導的糖尿病大鼠，術后6天血糖逐步下降，12～16天血糖降至15mmol/L以下，但20天后血糖逐步上升，治療作用消失。 (4)BrdU標記的BM-MSCs的陽性率約為5～10﹪，予門靜脈和胰腺局部注射法移植治療STZ誘導的糖尿病大鼠，2周血糖無明顯變化。胰腺局部注射組2周后胰腺內可見散在浸潤的BrdU陽性細胞，少數(shù)呈BrdU和胰島素雙陽性細胞團。門靜脈注射組2周后肝臟、胸腺、脾臟和胰腺內均可見局部浸潤的B

11、rdU陽性細胞，但僅在胰島內可見少數(shù)BrdU和胰島素雙陽性細胞。 (5)大鼠BM-MSCs和新鮮分離的胰島混合培養(yǎng)后，BM-MSCs呈貼壁生長，胰島半懸浮于BM-MSCs細胞層上。隨著培養(yǎng)時間的延長，胰島的存活率逐步下降?；旌吓囵B(yǎng)組第1、3、6、12天胰島的存活率明顯大于胰島單獨培養(yǎng)組(P＜0.01)。GSIS檢測結果顯示，第1天和第3天高糖可以明顯刺激胰島分泌胰島素(P＜0.01)，但隨著培養(yǎng)時間的延長，胰島對葡萄糖的反應性明

12、顯減弱，刺激指數(shù)從3.0～3.3降至1.7～1.8。第六天，體外培養(yǎng)的胰島喪失了對葡萄糖的反應性?；旌吓囵B(yǎng)組與單獨培養(yǎng)組胰島無顯著差異。胰島移植組術后8天內血糖可控制在15mmol/L以下，但隨后血糖逐步升高。BM-MSCs聯(lián)合胰島移植組術后血糖低于15mmol/L的時間可延長到12天，但隨后血糖亦逐步上升，治療作用消失，而BM-MSCs移植組血糖無明顯降低。 結論：(1)長期和一過性高血糖狀態(tài)均可以誘導大鼠骨髓出現(xiàn)胰島樣細胞，

13、可能是骨髓中的成體干細胞轉分化而來。 (2)體外培養(yǎng)可以獲得大量生物學特性均一的大鼠BM-MSCs，并具有成體干細胞的分化能力。 (3)大鼠BM-MSCs在體外可以誘導轉分化為胰島樣細胞。尼克酰胺和exendin-4可以有效促進BM-MSCs分化為功能性胰島素分泌細胞。 (4)BM-MSCs在糖尿病大鼠胰腺內可以轉分化為胰島素陽性細胞，但尚不能降低糖尿病大鼠血糖水平。 (5)體外培養(yǎng)條件下，BM-MSCs