兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為角膜上皮樣細(xì)胞的體外研究.pdf

1、目的： 角膜上皮層是覆蓋角膜表面的復(fù)層上皮組織，對于維持眼表的健康和穩(wěn)定具有重要作用。正常狀態(tài)下，角膜上皮細(xì)胞可以不斷的脫落、更新；外界因素引起的角膜上皮損傷也可很快修復(fù)。角膜上皮層的自我修復(fù)有賴于角膜緣基底層的成體干細(xì)胞——角膜緣干細(xì)胞(Limbal stem cells，LSCs)。 當(dāng)角膜緣受損，引起角膜緣干細(xì)胞缺乏或功能缺陷(Limbal stem cells deficiency，LSCD)時(shí)，會發(fā)生持續(xù)性角膜

2、上皮糜爛，角膜結(jié)膜上皮化，新生血管長入和假性翼狀胬肉形成等一系列病理改變，給患者帶來巨大的痛苦，甚至最終導(dǎo)致失明。隨著對LSCs研究的深入和發(fā)展，相繼出現(xiàn)了一系列針對上述疾病的治療方法，包括：羊膜移植、自體角膜緣移植、異體角膜緣移植及培養(yǎng)LSCs移植等。但是對于嚴(yán)重的LSCD，特別是雙眼LSCD，目前還沒有十分有效的治療方法，因此探討應(yīng)用其他干細(xì)胞系重建LSCs缺乏性眼表是目前亟待解決的問題。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchy

3、mal stem cells，MSCs)是來源于胚胎發(fā)育早期中胚層的一類多能干細(xì)胞，主要存在于骨髓，由于其高度的自我更新能力和多向分化潛能而受到廣泛的關(guān)注。大量文獻(xiàn)研究表明在適當(dāng)條件下，MSCs不但可分化成骨、軟骨、脂肪和肌肌肉等中胚層組織，還可以分化成腦、皮膚、視網(wǎng)膜等其他胚層的組織。這種跨系分化被稱為轉(zhuǎn)分化。研究證明MSCs可以分化為皮膚，肺及其他組織的上皮細(xì)胞，而近期研究發(fā)現(xiàn)將體外培養(yǎng)的人MSCs移植到損傷的兔或鼠角膜表面，可以重

4、建損傷眼表，其治療作用主要與抑制炎癥反應(yīng)和新生血管有關(guān)。這些研究結(jié)果提示MSCs在角膜組織損傷修復(fù)中具有潛在的重大應(yīng)用價(jià)值。 為檢測MSCs是否可以分化為角膜上皮細(xì)胞，我們用含有兔MSCs的膠原膜重建兔損傷眼表，結(jié)果顯示移植的兔MSCs到達(dá)角膜上皮基底層，并表達(dá)角膜上皮細(xì)胞的表面標(biāo)記抗原細(xì)胞角蛋白3(cytokeratin3)(已投稿)，說明MSCs具有向角膜上皮細(xì)胞分化的可能。 但目前關(guān)于MSCs向角膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化

5、的研究還十分有限；并且由于細(xì)胞融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，人們對于MSCs多向分化的可塑性存在一定爭議。因此進(jìn)一步研究MSCs向角膜上皮細(xì)胞分化的可行性，及這一過程中可能的參與因素具有重要意義。 為此本研究利用不同體外環(huán)境誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs，初步證明MSCs可以在體外誘導(dǎo)分化為角膜上皮樣細(xì)胞，并且在這一分化過程中表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)具有重要作用。本研究首次證明在體外誘導(dǎo)條件下MSCs可以分化為

6、角膜上皮樣細(xì)胞，為眼表疾病的細(xì)胞替代治療提供了新的理論基礎(chǔ)。 方法： 1、無菌條件下取兔骨髓，用密度為1.073的percoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法(800g，30分鐘)分離骨髓單核細(xì)胞層，DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以4.0×106/c㎡的密度接種，37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，正常換液、傳代。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60％～70％融合時(shí)，加入含有BrdU(濃度為10umol/L)的新鮮DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，以獲

7、得BrdU標(biāo)記的兔MSCs。 2、無菌條件下環(huán)形取1.5～2mm兔角膜緣組織，撕去角膜內(nèi)皮層，0.25％DispaseⅡ酶4℃消化18小時(shí)后，取角膜上皮層用0.25％胰酶+0.02％EDTA37℃消化10分鐘，1000轉(zhuǎn)離心10分鐘后，SHEM培養(yǎng)基重懸接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO2孵育箱中培養(yǎng)，正常換液、傳代。 3、用流式細(xì)胞技術(shù)檢測培養(yǎng)MSCs CD29、CD34表達(dá)情況。 4、用免疫熒光染色

8、法檢測培養(yǎng)的兔LSCs CK3、Integrinβ1和p63的表達(dá)情況。 5、取BrdU標(biāo)記的兔MSCs，在以下四種不同條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)三天。(同時(shí)設(shè)正常培養(yǎng)MSCs作為陰性對照組) A組：應(yīng)用Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板聯(lián)合培養(yǎng)兔MSCs和兔LSCs，兔MSCs接種于培養(yǎng)板的上層，兔LSCs接種于培養(yǎng)板的下層，培養(yǎng)基為新鮮SHEM培養(yǎng)基 B組：應(yīng)用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)兔MSCs，條件培養(yǎng)基為培養(yǎng)過兔LSCs的SHE

9、M培養(yǎng)基上清 C組：應(yīng)用新鮮SHEM培養(yǎng)基直接培養(yǎng)兔MSCs D組：應(yīng)用添加10ng/ml EGF的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)兔MSCs 6、用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測不同時(shí)間點(diǎn)，各組MSCs表達(dá)CK3的情況。 7、在上述四組體外培養(yǎng)系統(tǒng)中添加表皮生長因子抑制劑(AG1478)誘導(dǎo)培養(yǎng)三天(同時(shí)設(shè)正常培養(yǎng)MSCs作為陰性對照組)，用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測不同時(shí)間點(diǎn)，各組兔MSCs表達(dá)CK3的情況。

10、 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：流式分析數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±SD％表示，采用方差分析對各組結(jié)果進(jìn)行比較。(P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義) 結(jié)果： 1、培養(yǎng)的兔MSCs和兔LSCs形態(tài) 原代兔MSCs培養(yǎng)24小時(shí)后鏡下觀察有少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈長梭形，克隆樣生長。12～15天達(dá)80％融合，傳代后細(xì)胞狀態(tài)無明顯改變。原代培養(yǎng)兔LSCs培養(yǎng)24小時(shí)后大多數(shù)細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈不規(guī)則多角形，體積較小。接種3～4天形成含有8～10個(gè)細(xì)胞的小克

11、隆，10～14天達(dá)80％融合，傳代后細(xì)胞狀態(tài)無明顯改變。 2、培養(yǎng)的兔MSCs和兔LSCs表型 (1)兔MSCs的流式細(xì)胞鑒定：培養(yǎng)的兔MSCs CD29表達(dá)陽性的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的97.05％；而CD34陽性的細(xì)胞占5.15％。 (2)兔LSCs的免疫熒光鑒定：培養(yǎng)的兔LSCs Integrinβ1、p63表達(dá)陽性，CK3呈陰性表達(dá)。 3、體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后兔MSCs的檢測 (1)誘導(dǎo)后兔MSCs的形

12、態(tài)和表型特征：四組不同條件誘導(dǎo)培養(yǎng)的兔MSCs，均有部分細(xì)胞失去原有的成纖維細(xì)胞形態(tài)，分化為扁平的上皮細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞，免疫熒光染色結(jié)果顯示細(xì)胞表達(dá)CK3。CK3表達(dá)最早出現(xiàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)后的2小時(shí)，并在誘導(dǎo)培養(yǎng)的三天內(nèi)無明顯改變。 (2)誘導(dǎo)率分析：流式分析結(jié)果顯示，誘導(dǎo)培養(yǎng)第二天各組CK3表達(dá)量均有所升高(A組從3.46±1.9％增加到7.24±3.8％；B組從4.09±1.84％增加到9.31±5.92％；C組從3.48±1.39

13、％增加到5.61±3.82％；D組從1.84±0.47％增加到4.73±3.94％)，但第三天均有所降低(A組5.5±3.33％；B組4.37±2.61％；C組2.54±2.01％；D組1.68±0.88％)。各組與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但各組間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4、加入抑制劑誘導(dǎo)培養(yǎng)后兔MSCs的檢測 (1)免疫熒光染色結(jié)果： A組和B組兔MSCs在誘導(dǎo)培養(yǎng)后2小時(shí)，有部分貼壁細(xì)胞分化為扁平細(xì)胞形態(tài)的細(xì)

14、胞，并表達(dá)CK3，而后隨時(shí)間的延長未見CK3表達(dá)增加。C組和D組未見CK3表達(dá)陽性的細(xì)胞。 (2)流式分析結(jié)果：誘導(dǎo)培養(yǎng)三天內(nèi)A組CK3表達(dá)率第一天為1.44±0.18％，第二天升高到1.88±0.69％，第三天略有降低(1.76±0.15％)；B組CK3表達(dá)率在第一天為1.3±0.28％，第二天增高到2.73±0.45％，24小時(shí)后降低到2.3±1.11％；C組和D組CK3表達(dá)率基本穩(wěn)定(C組第一天0.78±0.16％，第二天

15、0.68±0.14％，第三天0.73±0.16％；D組第一天0.62±0.11％，第二天0.7±0.12％，第三天0.56±0.1％)。其中A組與B組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。C組與D組間差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對照組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但A組與C組、D組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均p<0.05)，同樣B組與C組、D組間差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均p<0.05)。 結(jié)論： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)