外源信號分子及腸道菌群對脆弱擬桿菌群體感應(yīng)的影響.pdf

1、研究背景：
　　 細菌之間的交流是通過分泌和感應(yīng)一種被稱為自誘導(dǎo)劑(Autoinducer，AI)的信號分子來實現(xiàn)的。細菌根據(jù)這種特定信號分子濃度的變化來監(jiān)測周圍環(huán)境中其他細菌數(shù)量的變化，這種信號傳遞的過程稱為群體感應(yīng)(Quorum-sensing，QS)?，F(xiàn)有報道的細菌QS環(huán)路有三種機制：革蘭陽性菌以修飾多肽作為信號調(diào)節(jié)分子；革蘭陰性菌主要以典型的Luxl/LuxR系統(tǒng)通過產(chǎn)生一類信號分子N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯類(AHL)進行

2、群體感應(yīng)；另外一種QS分子目前認為是二類信號分子(呋喃硼酸二酯)，為革蘭陰性菌和陽性菌共有。最近幾年，有關(guān)需氧菌的QS系統(tǒng)研究方興未艾，研究范圍越來越廣。但是，厭氧菌的QS系統(tǒng)類似研究至今還未見報道。
　　 脆弱擬桿菌占人體腸道菌群的比例約為1％-2％，是引起胃腸感染的最主要的厭氧菌，多種因素導(dǎo)致該菌可以在腸道內(nèi)大量存在并形成生物膜。脆弱擬桿菌生物膜形成是否與QS有關(guān)，該菌是否產(chǎn)生一類QS信號分子AHL，以及AHL與腸道菌群對該

3、菌生物學(xué)活性的影響，目前相關(guān)研究報道極少，因此，本研究重點研究了UPLC-MS(四極桿飛行時間質(zhì)譜，Q-TOF-MS)檢測AHL分子的影響因素，創(chuàng)建了基于UPLC-MS技術(shù)的細菌群體感應(yīng)一類信號分子AHL的檢測平臺，為系統(tǒng)研究腸道微生態(tài)細菌的信號傳導(dǎo)提供實驗技術(shù)和方法。另外采用分子生物學(xué)技術(shù)探討脆弱擬桿菌是否存在QS環(huán)路系統(tǒng)，同時分析了與脆弱擬桿菌密切相關(guān)的其他腸道細菌及外源性AHL對脆弱擬桿菌QS相關(guān)基因表達的影響，為進一步研究其群體

4、感應(yīng)發(fā)生機制奠定基礎(chǔ)。
　　 實驗一、N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯類群體感應(yīng)信號分子檢測方法的建立
　　 方法：采用UPLC/MS(Q-TOF-MS)代謝組學(xué)分析方法檢測6種N-酰基-高絲氨酸內(nèi)酯標準品，重點考察UPLC-MS檢測AHL分子的各種參數(shù)，包括溶劑的選擇、流動相的優(yōu)化、濾膜孔徑、質(zhì)譜的電噴霧離子化模式、色譜柱的選擇、質(zhì)譜條件的優(yōu)化、AHL提取分離的前處理條件、AHL分子在質(zhì)譜中的離子化特點等。
　　 結(jié)果：

5、創(chuàng)建了基于UPLC-MS技術(shù)的細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)一類信號分子AHL的檢測平臺，其檢測參數(shù)為：正離子電噴霧離子化模式、AquityC181.7μm2.1mm×100mm色譜柱，乙腈作為AHL溶劑及流動相。AHL內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)在質(zhì)譜鑒定過程中不會被破壞，在電噴霧電離四極桿飛行時間質(zhì)譜中總保持m/z為102.05和74.05的特征峰組合(N-已酰-DL-?；呓z氨酸內(nèi)酯只見102.05特征峰)，三氯甲烷甲醇水混合液作為萃取劑提取細菌培養(yǎng)液中AHL的

6、靈敏度為5ng/ml。
　　 實驗二、基于UPLC-MS技術(shù)檢測脆弱擬桿菌群體感應(yīng)一類信號分子AHL
　　 方法：采用PCR方法擴增實驗菌株(包括脆弱擬桿菌、5種雙歧桿菌、大腸埃希菌、屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌、傷寒沙門菌)的16SrRNA基因并測序，確保實驗菌株鑒定的準確性；在確定UPLC-MS(Q-TOF-MS)檢測AHL的各種檢測參數(shù)后，采用該方法對脆弱擬桿菌和其他多種細菌的菌液

7、提取物中是否存在AHL進行了檢測，并以AHL標準品做對照實驗。
　　 結(jié)果：實驗菌株16SrRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫序列同源性大于98％，采用UPLC-MS法檢測溶于不同細菌培養(yǎng)液中AHL標準品，其電噴霧電離四極桿飛行時間質(zhì)譜均見m/z為102.05特征離子碎片或102.05和74.05特征碎片組合(N-已酰-DL-?；呓z氨酸內(nèi)酯只見102.05特征峰)，而脆弱擬桿菌和其他多種細菌的菌液均未檢測到AHL。
　

8、　 實驗三、脆弱擬桿菌生物學(xué)特性的研究
　　 方法：采用甘油厭氧肉湯及甘油普通肉湯對脆弱擬桿菌進行保存，觀察在不同時間及不同溫度保存條件下的存活狀況，同時觀察反復(fù)凍融10次對其存活力的影響。另將脆弱擬桿菌菌液分別暴露在空氣中5min、10min、30min、60min、90min、120min、150min、180min、24h，觀察不同時間段脆弱擬桿菌的的生存力及生存率的變化。
　　 結(jié)果：接種于甘油厭氧肉湯及普通肉

9、湯中的脆弱擬桿菌在-20℃及-80℃兩種溫度下保存3個月后，反復(fù)凍融10次后均能培養(yǎng)成功，與空氣接觸180min時仍生存，24h后即死亡，與空氣接觸5min，10min，30min，60min后生存率分別為84.1％，68.1％，46.4％，34.8％。
　　 實驗四、外源信號分子及腸道菌群對脆弱擬桿菌生物學(xué)活性的影響
　　 方法：將5種腸道常見菌的培養(yǎng)上清液及2種AHL標準品加入?yún)捬跹囵B(yǎng)液中，用于脆弱擬桿菌培養(yǎng)，檢測

10、不同培養(yǎng)時間段的脆弱擬桿菌菌液OD值，分析其在不同培養(yǎng)環(huán)境的生長曲線變化。
　　 結(jié)果：脆弱擬桿菌在厭氧血培養(yǎng)液、含十二烷基高絲氨酸內(nèi)酯、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌上清液、酮乙?；呓z氨酸內(nèi)酯的厭氧血培養(yǎng)中培養(yǎng)時，其進入對數(shù)期的時間分別為8h、6h、6h、6h、10h、10h，其進入穩(wěn)定期時間分別為10h、8h、8h、8h、24h、24h，脆弱擬桿菌在含其他細菌上清液的厭氧血培養(yǎng)液中進入對數(shù)期及穩(wěn)定期的時間與空白厭氧血培

11、養(yǎng)液一致。
　　 實驗五、熒光定量PCR法檢測不同培養(yǎng)環(huán)境脆弱擬桿菌群體感應(yīng)相關(guān)基因的表達
　　 方法：采用PCR方法檢測群體感應(yīng)相關(guān)基因luxI及脆弱擬桿菌的luxR基因及其亞型，實時熒光定量PCR方法檢測腸道菌群及兩種AHL對脆弱擬桿菌不同亞型luxR基因的mRNA的相對表達量，并對其表達水平進行比較。
　　 結(jié)果：在脆弱擬桿菌基因組中，檢測到8種luxR同源的Qs類基因，只有LuxR8檢測陰性，表明這8種l

12、uxR同源基因參與該菌I型QS環(huán)路，脆弱擬桿菌基因組中未檢測到luxI和其他lux基因。不同luxR基因亞型表達量具有一定的時間趨勢，即培養(yǎng)6小時或4小時的表達量最高，而培養(yǎng)1小時表達量相對較低，8小時后表達下降；luxR1由于表達量少，故其各時間段的表達量基本一致，而luxR8基因不存在，相應(yīng)地也無mRNA表達。十二烷基高絲氨酸內(nèi)酯、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌對luxR基因表達上調(diào)，而酮乙酰基高絲氨酸內(nèi)酯和屎腸球菌對luxR基因表達下調(diào)

13、。
　　 結(jié)論：
　　 本課題在創(chuàng)建了基于UPLC-MS技術(shù)的細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)一類信號分子AHL的檢測平臺基礎(chǔ)上，通過對參與脆弱擬桿菌群體感應(yīng)的一類信號分子AHL和QS相關(guān)基因的篩查、不同外源性AHL及腸道菌群對脆弱擬桿菌生物學(xué)活性及l(fā)uxR基因表達影響的實驗研究，得出以下結(jié)論：
　　 1.脆弱擬桿菌具有一類群體感應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括LuxR調(diào)節(jié)因子參與，且LuxR調(diào)節(jié)因子具有多種亞型，LuxR調(diào)節(jié)因子可能與外源性

14、的信號分子結(jié)合而發(fā)揮群體感應(yīng)。
　　 2.脆弱擬桿菌不存在luxI基因，不產(chǎn)生?；呓z氨酸內(nèi)酯類自誘導(dǎo)信號分子。
　　 3.UPLC-MS(Q-TOF-MS)技術(shù)是檢測QS群體感應(yīng)系統(tǒng)一類信號分子一高絲氨酸內(nèi)酯的一種有效工具，具有準確度高、靈敏度高、精密度高、重復(fù)性好、檢測方便、線性范圍廣等特點，AHL在Q-TOF-MS中總保持m/z為102.05特征離子峰或102.05和74.05的特征峰組合(N-已酰-DL-?；呓z