2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:
   細菌之間的交流是通過分泌和感應(yīng)一種被稱為自誘導(dǎo)劑(Autoinducer,AI)的信號分子來實現(xiàn)的。細菌根據(jù)這種特定信號分子濃度的變化來監(jiān)測周圍環(huán)境中其他細菌數(shù)量的變化,這種信號傳遞的過程稱為群體感應(yīng)(Quorum-sensing,QS)?,F(xiàn)有報道的細菌QS環(huán)路有三種機制:革蘭陽性菌以修飾多肽作為信號調(diào)節(jié)分子;革蘭陰性菌主要以典型的Luxl/LuxR系統(tǒng)通過產(chǎn)生一類信號分子N-?;?高絲氨酸內(nèi)酯類(AHL)進行

2、群體感應(yīng);另外一種QS分子目前認為是二類信號分子(呋喃硼酸二酯),為革蘭陰性菌和陽性菌共有。最近幾年,有關(guān)需氧菌的QS系統(tǒng)研究方興未艾,研究范圍越來越廣。但是,厭氧菌的QS系統(tǒng)類似研究至今還未見報道。
   脆弱擬桿菌占人體腸道菌群的比例約為1%-2%,是引起胃腸感染的最主要的厭氧菌,多種因素導(dǎo)致該菌可以在腸道內(nèi)大量存在并形成生物膜。脆弱擬桿菌生物膜形成是否與QS有關(guān),該菌是否產(chǎn)生一類QS信號分子AHL,以及AHL與腸道菌群對該

3、菌生物學(xué)活性的影響,目前相關(guān)研究報道極少,因此,本研究重點研究了UPLC-MS(四極桿飛行時間質(zhì)譜,Q-TOF-MS)檢測AHL分子的影響因素,創(chuàng)建了基于UPLC-MS技術(shù)的細菌群體感應(yīng)一類信號分子AHL的檢測平臺,為系統(tǒng)研究腸道微生態(tài)細菌的信號傳導(dǎo)提供實驗技術(shù)和方法。另外采用分子生物學(xué)技術(shù)探討脆弱擬桿菌是否存在QS環(huán)路系統(tǒng),同時分析了與脆弱擬桿菌密切相關(guān)的其他腸道細菌及外源性AHL對脆弱擬桿菌QS相關(guān)基因表達的影響,為進一步研究其群體

4、感應(yīng)發(fā)生機制奠定基礎(chǔ)。
   實驗一、N-?;?高絲氨酸內(nèi)酯類群體感應(yīng)信號分子檢測方法的建立
   方法:采用UPLC/MS(Q-TOF-MS)代謝組學(xué)分析方法檢測6種N-酰基-高絲氨酸內(nèi)酯標準品,重點考察UPLC-MS檢測AHL分子的各種參數(shù),包括溶劑的選擇、流動相的優(yōu)化、濾膜孔徑、質(zhì)譜的電噴霧離子化模式、色譜柱的選擇、質(zhì)譜條件的優(yōu)化、AHL提取分離的前處理條件、AHL分子在質(zhì)譜中的離子化特點等。
   結(jié)果:

5、創(chuàng)建了基于UPLC-MS技術(shù)的細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)一類信號分子AHL的檢測平臺,其檢測參數(shù)為:正離子電噴霧離子化模式、AquityC181.7μm2.1mm×100mm色譜柱,乙腈作為AHL溶劑及流動相。AHL內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)在質(zhì)譜鑒定過程中不會被破壞,在電噴霧電離四極桿飛行時間質(zhì)譜中總保持m/z為102.05和74.05的特征峰組合(N-已酰-DL-?;呓z氨酸內(nèi)酯只見102.05特征峰),三氯甲烷甲醇水混合液作為萃取劑提取細菌培養(yǎng)液中AHL的

6、靈敏度為5ng/ml。
   實驗二、基于UPLC-MS技術(shù)檢測脆弱擬桿菌群體感應(yīng)一類信號分子AHL
   方法:采用PCR方法擴增實驗菌株(包括脆弱擬桿菌、5種雙歧桿菌、大腸埃希菌、屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌、傷寒沙門菌)的16SrRNA基因并測序,確保實驗菌株鑒定的準確性;在確定UPLC-MS(Q-TOF-MS)檢測AHL的各種檢測參數(shù)后,采用該方法對脆弱擬桿菌和其他多種細菌的菌液

7、提取物中是否存在AHL進行了檢測,并以AHL標準品做對照實驗。
   結(jié)果:實驗菌株16SrRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫序列同源性大于98%,采用UPLC-MS法檢測溶于不同細菌培養(yǎng)液中AHL標準品,其電噴霧電離四極桿飛行時間質(zhì)譜均見m/z為102.05特征離子碎片或102.05和74.05特征碎片組合(N-已酰-DL-?;呓z氨酸內(nèi)酯只見102.05特征峰),而脆弱擬桿菌和其他多種細菌的菌液均未檢測到AHL。
 

8、  實驗三、脆弱擬桿菌生物學(xué)特性的研究
   方法:采用甘油厭氧肉湯及甘油普通肉湯對脆弱擬桿菌進行保存,觀察在不同時間及不同溫度保存條件下的存活狀況,同時觀察反復(fù)凍融10次對其存活力的影響。另將脆弱擬桿菌菌液分別暴露在空氣中5min、10min、30min、60min、90min、120min、150min、180min、24h,觀察不同時間段脆弱擬桿菌的的生存力及生存率的變化。
   結(jié)果:接種于甘油厭氧肉湯及普通肉

9、湯中的脆弱擬桿菌在-20℃及-80℃兩種溫度下保存3個月后,反復(fù)凍融10次后均能培養(yǎng)成功,與空氣接觸180min時仍生存,24h后即死亡,與空氣接觸5min,10min,30min,60min后生存率分別為84.1%,68.1%,46.4%,34.8%。
   實驗四、外源信號分子及腸道菌群對脆弱擬桿菌生物學(xué)活性的影響
   方法:將5種腸道常見菌的培養(yǎng)上清液及2種AHL標準品加入?yún)捬跹囵B(yǎng)液中,用于脆弱擬桿菌培養(yǎng),檢測

10、不同培養(yǎng)時間段的脆弱擬桿菌菌液OD值,分析其在不同培養(yǎng)環(huán)境的生長曲線變化。
   結(jié)果:脆弱擬桿菌在厭氧血培養(yǎng)液、含十二烷基高絲氨酸內(nèi)酯、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌上清液、酮乙?;呓z氨酸內(nèi)酯的厭氧血培養(yǎng)中培養(yǎng)時,其進入對數(shù)期的時間分別為8h、6h、6h、6h、10h、10h,其進入穩(wěn)定期時間分別為10h、8h、8h、8h、24h、24h,脆弱擬桿菌在含其他細菌上清液的厭氧血培養(yǎng)液中進入對數(shù)期及穩(wěn)定期的時間與空白厭氧血培

11、養(yǎng)液一致。
   實驗五、熒光定量PCR法檢測不同培養(yǎng)環(huán)境脆弱擬桿菌群體感應(yīng)相關(guān)基因的表達
   方法:采用PCR方法檢測群體感應(yīng)相關(guān)基因luxI及脆弱擬桿菌的luxR基因及其亞型,實時熒光定量PCR方法檢測腸道菌群及兩種AHL對脆弱擬桿菌不同亞型luxR基因的mRNA的相對表達量,并對其表達水平進行比較。
   結(jié)果:在脆弱擬桿菌基因組中,檢測到8種luxR同源的Qs類基因,只有LuxR8檢測陰性,表明這8種l

12、uxR同源基因參與該菌I型QS環(huán)路,脆弱擬桿菌基因組中未檢測到luxI和其他lux基因。不同luxR基因亞型表達量具有一定的時間趨勢,即培養(yǎng)6小時或4小時的表達量最高,而培養(yǎng)1小時表達量相對較低,8小時后表達下降;luxR1由于表達量少,故其各時間段的表達量基本一致,而luxR8基因不存在,相應(yīng)地也無mRNA表達。十二烷基高絲氨酸內(nèi)酯、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌對luxR基因表達上調(diào),而酮乙酰基高絲氨酸內(nèi)酯和屎腸球菌對luxR基因表達下調(diào)

13、。
   結(jié)論:
   本課題在創(chuàng)建了基于UPLC-MS技術(shù)的細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)一類信號分子AHL的檢測平臺基礎(chǔ)上,通過對參與脆弱擬桿菌群體感應(yīng)的一類信號分子AHL和QS相關(guān)基因的篩查、不同外源性AHL及腸道菌群對脆弱擬桿菌生物學(xué)活性及l(fā)uxR基因表達影響的實驗研究,得出以下結(jié)論:
   1.脆弱擬桿菌具有一類群體感應(yīng)系統(tǒng),該系統(tǒng)包括LuxR調(diào)節(jié)因子參與,且LuxR調(diào)節(jié)因子具有多種亞型,LuxR調(diào)節(jié)因子可能與外源性

14、的信號分子結(jié)合而發(fā)揮群體感應(yīng)。
   2.脆弱擬桿菌不存在luxI基因,不產(chǎn)生?;呓z氨酸內(nèi)酯類自誘導(dǎo)信號分子。
   3.UPLC-MS(Q-TOF-MS)技術(shù)是檢測QS群體感應(yīng)系統(tǒng)一類信號分子一高絲氨酸內(nèi)酯的一種有效工具,具有準確度高、靈敏度高、精密度高、重復(fù)性好、檢測方便、線性范圍廣等特點,AHL在Q-TOF-MS中總保持m/z為102.05特征離子峰或102.05和74.05的特征峰組合(N-已酰-DL-?;呓z

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