大黃魚腐敗希瓦氏菌群體感應信號分子AHLs對其致腐性的影響及機制研究.pdf

1、水產(chǎn)品腐敗主要是由微生物引起的，而大黃魚肉質(zhì)中水分含量高、可溶性蛋白含量高、組織結(jié)構(gòu)松散，更容易滋生微生物引起腐敗。在低溫貯藏條件下水產(chǎn)品中主要的特定腐敗菌為假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）和希瓦氏菌屬（Shewanella spp.）。水產(chǎn)品的腐敗過程主要是由細菌群體感應系統(tǒng)調(diào)控的，其中在革蘭氏陰性菌中典型的群體感應信號分子是?；呓z氨酸內(nèi)酯類（AHLs），已在大多數(shù)革蘭氏陰性菌中檢測到，但是在波羅的海希瓦氏菌（Shew

2、anella baltica）中還沒有相關報道，群體感應信號分子調(diào)控水產(chǎn)品腐敗的機制也鮮有報道。鑒于此，本研究采用一種高效、高靈敏度的液質(zhì)聯(lián)用(UPLC-QqQ-MS/MS)技術檢測S.baltica上清液中AHLs信號分子，研究了不同S.baltica菌株致腐能力的差異以及外源AHLs對S.baltica致腐能力的影響，并初步研究了群體感應信號分子產(chǎn)生的基因調(diào)控及其誘導腐敗相關基因表達的機制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.建立UP

3、LC-QqQ-MS/MS檢測體系，快速高效地在5.6 min內(nèi)檢測11種AHLs(r2＞0.99)。對四種菌株上清液中AHEs提取條件進行比較，采用乙酸乙酯（0.1％甲酸酸化）作為萃取劑能夠檢測到響應的信號（1ng/ml），且回收率大于88.4％。首次在S.baltica菌株檢測到了AHLs信號分子，12/18株被檢測到，除了C7-HSL、C14-HSL其它9種的信號分子均在上清液中被檢測到，其中C10-HSL信號分子是大多數(shù)菌株產(chǎn)生的

4、，也是產(chǎn)生數(shù)量較多的信號分子。不同的S.baltica菌株產(chǎn)生AHLs信號分子的種類、數(shù)量以及產(chǎn)生的時間點不同。
　　2.外源AHLs信號分子對S.baltica100菌株生長曲線和細菌數(shù)量沒有顯著影響，但是對S.baltica生物被膜的形成、TVB-N的生成、蛋白酶水解活性有一定的促進作用。結(jié)合RCBD數(shù)據(jù)模型分析得出，C10-HSL信號分子顯著提高了S.baltica100菌株生物被膜的聚集吸附能力和密集程度，促進了生物被膜的

5、成熟與穩(wěn)定;羰基官能團對于信號分子的添加增強生物被膜的形成能力并沒有起到關鍵性的作用;不同的AHLs對調(diào)控S.baltica100菌株生物被膜形成發(fā)揮作用的時間段不同。外源AHLs信號分子的添加對強和弱致腐能力菌株產(chǎn)TVB-N的影響影響較顯著;4℃放置1d的條件下，添加C8-HSL、3-oxo-C8-HSL、C10-HSL、3-oxo-C10-HSL誘導組的TVB-N顯著提高，4d之后信號分子的添加組與對照組的差別很小。S.baltic

6、a100菌株在添加11種信號分子誘導后，C8-HSL、3-oxo-C12-HSL添加組的透明圈明顯變大，顯著增強蛋白酶水解活性;C7-HSL、C14-HSL抑制了蛋白酶水解活性。外源AHLs對菌株的致腐能力的影響與該菌株檢測到的信號分子的種類和數(shù)量并沒有發(fā)現(xiàn)直接的相關聯(lián)系。
　　3.所有待測S.baltica菌株上清液都能誘導哈維氏弧菌BB170產(chǎn)生熒光，且都是在指數(shù)后期達到最大值，在穩(wěn)定期熒光值急劇下降。AI-2的轉(zhuǎn)錄水平和pf

7、s的轉(zhuǎn)錄水平有較高的相關性，而與luxS轉(zhuǎn)錄水平不完全一致，AI-2濃度的變化部份地歸因于pfs表達水平的改變。S.baltica菌株分泌AHLs的含量與luxR轉(zhuǎn)錄水平的最大值均出現(xiàn)在指數(shù)中期至指數(shù)后期的培養(yǎng)過程中，且二者的變化趨勢均為先增后減，并且發(fā)現(xiàn)?；鶄?cè)鏈較短的AHL信號分子上調(diào)luxR表達水平的影響較顯著。S.baltica菌株致腐能力的強弱與腐敗相關基因（torT、 torA）的表達水平呈正相關，同一種AHLs信號分子的添加