FimH蛋白對尿路細胞TLR4及其相關(guān)細胞因子的表達和抗感染作用的影響.pdf

1、目的:尿路感染(urinary tract infection,UTI)是常見的感染性疾病,80％以上由尿路致病性大腸桿菌(UPEC)引起。FimH蛋白是UPECⅠ型菌毛的頂端蛋白,是細菌感染尿路細胞的關(guān)鍵因素,它能特異地與膀胱表皮細胞表面的甘露糖糖蛋白結(jié)合,誘導(dǎo)宿主細胞局部重排而直接介導(dǎo)UPEC的侵入,引起膀胱炎和反復(fù)發(fā)作的尿路感染(UTIs),目前己成為預(yù)防細菌性尿路感染的候選靶蛋白。用FimH蛋白免疫動物,可誘導(dǎo)高水平特異性Fim

2、H抗體(IgG和SIgA)的產(chǎn)生,并能與90％以上的表達有FimH的大腸桿菌發(fā)生交叉反應(yīng),對尿路感染具有一定的保護作用。我們以前的研究也得到了相似的結(jié)果。
　　 研究發(fā)現(xiàn),FimH蛋白是TLR4的一種新的病原相關(guān)分子模式,能夠直接與巨噬細胞表面的TLR4結(jié)合,通過MyD88依賴的信號通路的激活,促進TNF-α等細胞因子的產(chǎn)生,提高小鼠腹腔巨噬細胞的抗病毒活性。此外,FimH還可通過TLR4依賴的途徑激活NK細胞,產(chǎn)生IFN-γ提

3、高NK細胞抗病毒活性?？梢奆imH蛋白對固有性免疫也具有調(diào)節(jié)作用。TLR4也表達于尿路上皮細胞,參與尿路細胞的抗感染作用,且FimH蛋白對尿路細胞和TLR4的作用還未見研究報道。
　　 本課題旨在研究FimH蛋白對膀胱上皮細胞,腎小管內(nèi)皮細胞TLR4表達和相關(guān)炎癥因子的調(diào)節(jié)作用,研究FimH蛋白對尿路細胞的抗菌作用的影響,以及對小鼠膀胱感染模型中炎癥反應(yīng)強度的影響,為進一步研究FimH蛋白對尿路粘膜固有性免疫的調(diào)節(jié)作用提供實驗依

4、據(jù)。
　　 方法:
　　 1目的蛋白的純化:將本室已構(gòu)建的原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-2-fimH轉(zhuǎn)染感受態(tài)E.coli BL-21,用IPTG誘導(dǎo)表達蛋白FimH,經(jīng)SDS-PAGE鑒定后,純化、定量;MTT法檢測融合蛋白的細胞毒性;鱟變形細胞溶解物L(fēng)PS試劑盒測定LPS含量。
　　 2將制備的FimH蛋白取不同濃度分別刺激膀胱上皮癌5637細胞株、腎小管癌上皮A498細胞株和巨噬細胞Thp-1,流式細胞儀檢測

5、細胞表面TLR4的表達變化,應(yīng)用Real-Time PCR檢測細胞因子IL-6、IL-8、TNF-αmRNA的表達變化。
　　 3不同濃度的FimH蛋白刺激5637細胞48小時,加入大腸桿菌U30共培養(yǎng)2h,洗去細胞外的U30菌,用0.2％的Triton-X100溶解細胞,溶解液稀釋后用LB平板培養(yǎng)過夜,菌落計數(shù),評價FimH蛋白對膀胱細胞抗菌作用的影響。
　　 4.將制備的FimH蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,設(shè)空白對

6、照組(注射生理鹽水),100ug/只,每組15只,連續(xù)注射7天后取小鼠膀胱和腎組織,Real-time PCR檢測IL-6,TNF-α等細胞因子,免疫組化觀察組織TLR4表達。
　　 5用U30菌經(jīng)尿道上行感染小鼠,制備成膀胱感染模型,將FimH蛋白腹腔注射感染小鼠,共三天,以生理鹽水為對照,每組15只,Real-timePCR檢Nd,鼠膀胱和腎組織IL-6,TNF-a等細胞因子mRNA的表達,膀胱HE染色觀察FimH蛋白作用后

7、膀胱組織炎癥侵潤程度。
　　 結(jié)果:
　　 1成功純化目的蛋白FimH,蛋白定量濃度為166.5ug/ml,檢測蛋白LPS含量為1030pg/ml,即FimH蛋白中內(nèi)毒素含量為6.18pg/ug,參考文獻報道當(dāng)FimH蛋白溶液內(nèi)為LPS4～7pg/ug時,LPS無活性作用。經(jīng)MTT法檢測證明當(dāng)?shù)鞍譌imH濃度≤25ug/ml時對細胞無毒性。
　　 2流式細胞儀檢測FimH作用于5637、A498和THP-1三種細

8、胞48h后,細胞表面TLR4的表達水平均較空白對照組顯著增高(P＜0.05)。
　　 3 FimH作用于膀胱癌上皮細胞株5637、腎小管癌上皮細胞株A498和巨噬細胞THP-124h后Real-time PCR檢測顯示:5637和A498的IL-6,IL-8 mRNA表達水平一致性增高,TNF-α,MyD88則無明顯變化;THP-1細胞IL-6、TNF-α、MyD88 mRNA表達與空白對照組和LPS對照組比較均顯著升高(P＜0

9、.05)。
　　 4 U30細菌刺激低、中、高濃度FimH蛋白分別作用的5637細胞顯示:與對照組細菌數(shù)(230±69)相比,FimH0.5μg/ml、2.Sμg/ml和12.5μg/ml濃度蛋白作用組內(nèi)U30細菌數(shù)顯著降低(P＜0.05),有統(tǒng)計學(xué)意義;其中中濃度(2.5μg/ml)FimH蛋白作用組5637細胞內(nèi)細菌數(shù)(77±20)呈下降趨勢最明顯。
　　 5 FimH蛋白作用小鼠膀胱和腎IL-6,TNF-α mRN

10、A表達水平顯著增高(P＜0.01),且膀胱組織TNF-α mRNA表達明顯高于腎組織;免疫組化顯示FimH蛋白作用組小鼠膀胱、腎組織TLR4表達量均高于生理鹽水對照組。
　　 6感染模型小鼠應(yīng)用FimH蛋白后,膀胱和腎IL-6,TNF-α mRNA表達水平顯著高于對照組(P＜0.05)。膀胱組織HE染色顯示與生理鹽水對照組比較FimH作用組膀胱組織炎細胞浸潤減少,粘膜表面平滑、完整。
　　 結(jié)論:
　　 1尿路致

11、病性大腸桿菌的FimH蛋白,能顯著提高5637細胞、A498細胞和THP-1細胞表面TLR4的表達,在體內(nèi)也能促進膀胱、腎臟細胞TLR4的表達。
　　 2 FimH蛋白能促進5637細胞和A498細胞IL-6,IL-8 mRNA表達增高,且可能是以MyD88非依賴途徑。而FimH蛋白作用與THP-1細胞,顯著促進IL-6和TNF-α mRNA的表達且以MyD88依賴途徑。
　　 3 FimH蛋白能顯著增強5637細胞對U