TLR7信號通路的激活對Hela細胞增殖及細胞因子表達的影響.pdf

1、目的：(1)探討 TLR7在 Hela細胞中的表達；(2)TLR7信號通路激活后對 Hela細胞相關細胞因子、增殖、細胞周期的影響。
　　方法：(1)培養(yǎng)Hela細胞,采用熒光定量PCR(Real-time PCR)及Western Blot的方法分析 TLR7在 Hela細胞中的表達,同時用正常人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)作為陽性對照。(2)Western-B

2、lot分析Gardiquimod對 Hela細胞絲裂原蛋白激活激酶-胞外信號調節(jié)激酶(MAPKs-ERK1/2)及磷脂酰肌醇激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K-AKT)蛋白磷酸化水平的影響,以及MAPKs-ERK1/2特異性阻斷劑PD98059,PI3K-AKT特異性阻斷劑 LY294002阻斷這兩個信號通路,其磷酸化蛋白水平的變化。(3)通過Real-time PCR分析不同時間點 Gardiquimod對 Hela細胞下游 VEGF

3、,TIMP1,MMP2,IL-6,IL-15表達變化的影響,并通過特異性的信號通路阻斷劑PD98059,LY294002分析下游的VEGF,TIMP1等表達的變化是否依賴上述MAPKs-ERK1/2及PI3K-AKT這兩條信號通路的蛋白磷酸化水平的變化。(4)使用不同濃度的TLR7激動劑Gardiquimod經過不同的時間刺激 Hela細胞,采用MTT比色法分析其對Hela細胞增殖的影響。(5)流式細胞技術檢測Gardiquimod作用

4、于Hela細胞后其細胞周期的變化。(6)Western-Blot分析Hela細胞中TLR7激活后,細胞周期蛋白B1(CyclinB1)及細胞周期蛋白E(CyclinE)表達的變化。
　　結果：(1)Real-time PCR及Western-Blot結果顯示,與PBMC相比,TLR7在Hela細胞呈現組成性弱表達。(2)Western-Blot結果表明,Gardiquimod激活TLR7后可以顯著增加 Hela細胞中 ERK1/2

5、和AKT的蛋白磷酸化水平,特異性的阻斷劑 PD98059,LY294002研究顯示,Gardiquimod依賴MAPK-ERK1/2和PI3K-AKT途徑發(fā)揮其促進Hela細胞增殖的作用。(3)Real-time PCR分析,Gardiquimod經不同時間處理Hela細胞后,其下游VEGF,TIMP1,MMP2,IL-6,IL-15的表達都有不同程度的增加,并用上述特異性的信號阻斷劑后,其下游 VEGF等因子的表達呈現不同程度的降低。

6、(4)MTT結果顯示,TLR7激動劑Gardiquimod可促進Hela細胞的增殖,且呈時間及劑量效應。(5)流式細胞檢測結果表明,TLR7配體促進Hela細胞的增殖。(6)Western-Blot結果顯示,Gardiquimod可上調Hela細胞中CyclinB1和CyclinE蛋白的表達。
　　結論：Gardiquimod通過MAPKs-ERK1/2和PI3K-AKT信號通路誘導Hela細胞下游VEGF等因子的表達,并促進 H