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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
①了解人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞系Bewo細(xì)胞HBV感染與TLR3蛋白表達(dá)的關(guān)系;
②探討HBV刺激的Bewo細(xì)胞TLR3與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)系;
③探討TLR3和相關(guān)細(xì)胞因子在Bewo細(xì)胞抗HBV中的作用。
方法:
(1)培養(yǎng)人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞系Bewo細(xì)胞,分為PolyI:C(TLR3配體)刺激組及對(duì)照組Bewo細(xì)胞,采用FAC(流式細(xì)胞技術(shù))測(cè)定的T
2、LR3表達(dá);
(2)采用100μlHBVDNA含量為5.0×106(copies/ml)的血清與Bewo細(xì)胞共培養(yǎng)作為HBV感染方法,設(shè)立三組:空白對(duì)照組,HBV刺激組,PolyI:C+HBV刺激組。于HBV刺激8h、16h、24h、48h后收集培養(yǎng)上清及細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):①FACS測(cè)定空白對(duì)照組、HBV刺激組和PolyI::C+HBV刺激組Bewo細(xì)胞TLR3的表達(dá)以及不同刺激時(shí)間點(diǎn)的TLR3表達(dá)變化;②用ELISA法(
3、酶聯(lián)免疫吸附法)檢測(cè)HBV刺激組和PolyI:C+HBV刺激組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-β的含量;③用FQ-PCR(熒光定量PCR)檢測(cè)HBV刺激組及PolyI:C+HBV刺激組細(xì)胞培養(yǎng)液以及Bewo細(xì)胞中HBVDNA病毒載量。
結(jié)果:
①PolyI::C刺激組Bewo細(xì)胞TLR3蛋白平均熒光強(qiáng)度為53.58±3.11,對(duì)照組細(xì)胞為42.14±3.85,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(
4、t=-10.721,P<0.001)。
②用FAC檢測(cè)HBV刺激不同的時(shí)間點(diǎn)(8h、16h、24h、48h)Bewo細(xì)胞的TLR3蛋白含量,表達(dá)水平在空白對(duì)照組、HBV刺激組及PolyI:C+HBV刺激組中四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),對(duì)照組的Bewo細(xì)胞4個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)TLR3蛋白平均熒光強(qiáng)度分別為47.93、50.13、54.70、50.70,HBV刺激可使TLR3蛋白水平升高,在8h為59.85,16h為
5、70.45,24h為79.18,48h為87.27,且隨時(shí)間變化TLR3蛋白表達(dá)水平有升高趨勢(shì),PolyI:C+HBV刺激組TLR3蛋白量高于對(duì)照組及HBV刺激組,8h為68.67,16h為82.98,24h達(dá)到94.08,48h為79.66,24hTLR3蛋白達(dá)到高峰值。
③與HBV刺激組相比,PolyI:C+HBV刺激組IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-β含量在不同的時(shí)間點(diǎn)(8h、16h、24h、48h)表達(dá)水
6、平均有顯著性差異,且隨著時(shí)間延長表達(dá)水平上升;TNF-α在與HBV共培養(yǎng)8h時(shí)表達(dá)量即開始上升,IL-6是在24h后升高幅度較大,IL-10的濃度在HBV感染組表現(xiàn)為遲緩上升,而PolyI:C+HBV感染組16h小時(shí)后上升幅度加大,IFN-β隨著與HBV共培養(yǎng)的時(shí)間的增加呈現(xiàn)低幅度緩慢上升。與HBV刺激組相比,PolyI:C+HBV刺激組IL-2表達(dá)量未呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
④用FQ-PCR檢測(cè)HBVDNA,結(jié)果顯示:Poly
7、I:C+HBV刺激組培養(yǎng)上清中HBVDNA含量均低于HBV刺激組,在HBV刺激8h時(shí),兩組HBVDNA含量尚未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=3.635,P>0.05),但在刺激16h之后,兩組HBVDNA水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=12.728,P<0.05;t=7.603,P<0.05:t=11.314,P<0.05)。
結(jié)論:
①HBV刺激后Bewo細(xì)胞TLR3蛋白表達(dá)增加;PolyI:C可通過上調(diào)Bewo細(xì)胞TLR3蛋
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