TLR3及其相關(guān)細(xì)胞因子在Bewo細(xì)胞抗HBV感染中的作用.pdf

1、目的：
　　 ①了解人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞系Bewo細(xì)胞HBV感染與TLR3蛋白表達(dá)的關(guān)系；
　　 ②探討HBV刺激的Bewo細(xì)胞TLR3與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)系；
　　 ③探討TLR3和相關(guān)細(xì)胞因子在Bewo細(xì)胞抗HBV中的作用。
　　 方法：
　　 (1)培養(yǎng)人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞系Bewo細(xì)胞，分為PolyI：C(TLR3配體)刺激組及對(duì)照組Bewo細(xì)胞，采用FAC(流式細(xì)胞技術(shù))測(cè)定的T

2、LR3表達(dá)；
　　 (2)采用100μlHBVDNA含量為5.0×106(copies/ml)的血清與Bewo細(xì)胞共培養(yǎng)作為HBV感染方法，設(shè)立三組：空白對(duì)照組，HBV刺激組，PolyI：C+HBV刺激組。于HBV刺激8h、16h、24h、48h后收集培養(yǎng)上清及細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：①FACS測(cè)定空白對(duì)照組、HBV刺激組和PolyI::C+HBV刺激組Bewo細(xì)胞TLR3的表達(dá)以及不同刺激時(shí)間點(diǎn)的TLR3表達(dá)變化；②用ELISA法(

3、酶聯(lián)免疫吸附法)檢測(cè)HBV刺激組和PolyI：C+HBV刺激組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-β的含量；③用FQ-PCR(熒光定量PCR)檢測(cè)HBV刺激組及PolyI：C+HBV刺激組細(xì)胞培養(yǎng)液以及Bewo細(xì)胞中HBVDNA病毒載量。
　　 結(jié)果：
　　 ①PolyI::C刺激組Bewo細(xì)胞TLR3蛋白平均熒光強(qiáng)度為53.58±3.11，對(duì)照組細(xì)胞為42.14±3.85，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

4、t=-10.721，P＜0.001)。
　　 ②用FAC檢測(cè)HBV刺激不同的時(shí)間點(diǎn)(8h、16h、24h、48h)Bewo細(xì)胞的TLR3蛋白含量，表達(dá)水平在空白對(duì)照組、HBV刺激組及PolyI：C+HBV刺激組中四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，對(duì)照組的Bewo細(xì)胞4個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)TLR3蛋白平均熒光強(qiáng)度分別為47.93、50.13、54.70、50.70，HBV刺激可使TLR3蛋白水平升高，在8h為59.85，16h為

5、70.45，24h為79.18，48h為87.27，且隨時(shí)間變化TLR3蛋白表達(dá)水平有升高趨勢(shì)，PolyI：C+HBV刺激組TLR3蛋白量高于對(duì)照組及HBV刺激組，8h為68.67，16h為82.98，24h達(dá)到94.08，48h為79.66，24hTLR3蛋白達(dá)到高峰值。
　　 ③與HBV刺激組相比，PolyI：C+HBV刺激組IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-β含量在不同的時(shí)間點(diǎn)(8h、16h、24h、48h)表達(dá)水

6、平均有顯著性差異，且隨著時(shí)間延長表達(dá)水平上升；TNF-α在與HBV共培養(yǎng)8h時(shí)表達(dá)量即開始上升，IL-6是在24h后升高幅度較大，IL-10的濃度在HBV感染組表現(xiàn)為遲緩上升，而PolyI：C+HBV感染組16h小時(shí)后上升幅度加大，IFN-β隨著與HBV共培養(yǎng)的時(shí)間的增加呈現(xiàn)低幅度緩慢上升。與HBV刺激組相比，PolyI：C+HBV刺激組IL-2表達(dá)量未呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 ④用FQ-PCR檢測(cè)HBVDNA，結(jié)果顯示：Poly

7、I：C+HBV刺激組培養(yǎng)上清中HBVDNA含量均低于HBV刺激組，在HBV刺激8h時(shí)，兩組HBVDNA含量尚未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=3.635，P＞0.05)，但在刺激16h之后，兩組HBVDNA水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=12.728，P＜0.05；t=7.603，P＜0.05：t=11.314，P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 ①HBV刺激后Bewo細(xì)胞TLR3蛋白表達(dá)增加；PolyI：C可通過上調(diào)Bewo細(xì)胞TLR3蛋