OxLDL和oxHDL對(duì)ECV304內(nèi)皮細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)的影響及其對(duì)人單核細(xì)胞趨化作用的變化.pdf

1、研究背景: 大量證據(jù)證明動(dòng)脈粥樣硬化是一種在發(fā)病起始和整個(gè)過程中都伴有免疫反應(yīng)的炎癥性疾病。固有免疫反應(yīng)是機(jī)體的第一道防線，它識(shí)別高度保守的病原相關(guān)分子模式。在這第一道防線中，識(shí)別病原相關(guān)分子模式的受體中主要有Toll樣受體和清道夫受體。研究表明，TLR2和TLR4在人的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)顯著提高。TLR2和TLR4在人動(dòng)脈粥樣硬化病變中與炎癥的激活相關(guān)，他們促發(fā)了動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程中的固有免疫反應(yīng)。動(dòng)脈粥樣硬化是以脂質(zhì)

2、和炎癥細(xì)胞在血管壁的堆積為特點(diǎn)的。當(dāng)循環(huán)中的脂蛋白堆積，聚集并在血管內(nèi)膜下被修飾后，引起并推進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。這導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的浸潤和巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)攝取的失調(diào)。研究表明TLR2和TLR4受到配體的刺激以后可以引發(fā)多種細(xì)胞因子和炎癥分子的合成和釋放，如MCP-1，IL-8，粘附分子等。其中有很多重要的分子與動(dòng)脈粥樣硬化起始過程都是密切相關(guān)的。另外，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制當(dāng)中，脂蛋白的作用已經(jīng)比較明確，但是免疫反應(yīng)在其中的作用仍然不清楚

3、。因此，本研究意在探討修飾的脂蛋白對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)的影響，以及內(nèi)皮細(xì)胞TLR2和TLR4對(duì)單核細(xì)胞趨化的影響。 目的: 觀察oxLDL，oxHDL對(duì)ECV304人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞膜上TLR2、TLR4受體表達(dá)的影響，以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TLR2、TLR4受到這兩種脂蛋白刺激后對(duì)THP-1趨化作用的改變。 方法: 每次實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)，給ECV304內(nèi)皮細(xì)胞換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)后加處理因素。用不同濃

4、度（0 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L）的oxLDL和oxHDL孵育ECV304內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)后，用RT-PCR的方法檢測細(xì)胞TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)的水平，篩選出最適的處理濃度。用該濃度處理ECV304內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)后，用RT-PCR的方法檢測細(xì)胞TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)的水平，用Western blot 的方法檢測TLR2和TLR4蛋白表達(dá)水平。將ECV304內(nèi)皮細(xì)胞種于Transwe

5、ll下室后，用最適濃度的oxLDL和oxHDL處理內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)，然后在上室種THP-1單核細(xì)胞，計(jì)數(shù)下室的THP-1單核細(xì)胞。將ECV304內(nèi)皮細(xì)胞種于Transwell下室后，用最適濃度的oxLDL和oxHDL處理內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)，用5μmol/LEGCG孵育內(nèi)皮細(xì)胞1小時(shí)，抑制其TLRs信號(hào)后，再將THP-1細(xì)胞種到上室然后，計(jì)數(shù)下室的THP-1單核細(xì)胞，觀察THP-1單核細(xì)胞趨化的情況。 結(jié)果: 用不同濃度的（

6、0 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L）的oxLDL和oxHDL孵育ECV304內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)后，ECV304內(nèi)皮細(xì)胞上TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)隨處理濃度的升高增強(qiáng)。在100 mg/L oxLDL和100 mg/L oxHDL的作用下，ECV304內(nèi)皮細(xì)胞上TLR2和TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。將ECV304內(nèi)皮細(xì)胞種植到transwell下室并用oxLDL和oxHDL處理細(xì)胞后， ECV

7、304內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)THP-1單核細(xì)胞的趨化作用明顯增強(qiáng)。當(dāng)用5μmol/L EGCG抑制TLRs信號(hào)途徑后，內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)THP-1單核細(xì)胞的這種趨化作用卻明顯減弱。 結(jié)論: （1）在人ECV304內(nèi)皮細(xì)胞上存在有TLR2和TLR4基因的表達(dá)； （2）oxLDL和oxHDL可以上調(diào)ECV304內(nèi)皮細(xì)胞TLR2和TLR4的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)； （3）oxLDL和oxHDL刺激ECV304內(nèi)皮細(xì)胞上TLR2和T