豬鏈球菌2型對(duì)細(xì)胞的粘附作用和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的影響.pdf

1、豬鏈球菌2型（Streptococcus suis serotype2，SS2）是一種是在世界范圍內(nèi)引起豬多種形式感染的病原;也是一種人畜共患病病原，可引起人腦膜炎，嚴(yán)重危害著養(yǎng)豬業(yè)及相關(guān)從業(yè)人員的安全。目前雖然SS2感染后致病機(jī)理仍然沒(méi)有完全明確，但認(rèn)為細(xì)菌粘附作用及炎癥反應(yīng)在致病過(guò)程中起重要作用。細(xì)菌粘附并侵襲細(xì)胞在細(xì)菌定植黏膜屏障過(guò)程中不是必須的，但它們是細(xì)菌定植的重要一步。一旦細(xì)菌進(jìn)入血液循環(huán)和/或達(dá)到深層組織，將會(huì)受到先天性免

2、疫系統(tǒng)中吞噬細(xì)胞的作用;但SS能夠抵御吞噬作用，并以高濃度細(xì)菌在血液中持續(xù)存在，結(jié)果引發(fā)炎癥。但細(xì)菌粘附能力是否可以作為細(xì)菌致病力的標(biāo)志，不同SS2菌株粘附能力的差異的分子機(jī)制仍未得到很好的闡明。研究單核細(xì)胞與細(xì)菌相互作用的過(guò)程中，單核細(xì)胞釋放的炎性相關(guān)細(xì)胞因子，對(duì)闡明SS2介導(dǎo)和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中具有一定的意義。
　　 本研究選擇不同來(lái)源的具有不同毒力因子的SS2菌株與PK-15、HEp-2及PIEC細(xì)胞共孵育3h后，觀察SS2菌

3、株粘附細(xì)胞的能力。并通過(guò)建立SS2粘附因子的熒光定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)粘附試驗(yàn)所用菌株的粘附因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，以確定粘附因子轉(zhuǎn)錄水平是否影響細(xì)菌粘附細(xì)胞的能力。同時(shí)通過(guò)建立豬細(xì)胞因子IL-1β、IL-18、IL-8、IL-12和IL-10的熒光定量PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)部分菌株刺激3D4豬肺泡巨噬細(xì)胞后上述細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　 1.SS2對(duì)PK-15、HEp-2和PIEC細(xì)胞的粘附作用用1.0×107

4、CFU SS2菌株分別與PK-15、HEp-2和PIEC等3種細(xì)胞孵育3h后，平板計(jì)數(shù)。結(jié)果表明不同菌株對(duì)同一種細(xì)胞的粘附能力不同，同一株細(xì)菌對(duì)3種細(xì)胞的粘附能力也不同。相關(guān)蛋白酶處理后的細(xì)菌可以減弱這種粘附作用。表明SS2具有粘附相關(guān)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的能力，且這種粘附能力與菌株和細(xì)胞類型均有關(guān)聯(lián)。而細(xì)菌粘附能力強(qiáng)弱與細(xì)菌毒力強(qiáng)弱之間沒(méi)有必然的關(guān)系。
　　 2.豬鏈球菌2型粘附因子SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法的

5、建立及體外mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)根據(jù)已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的SS2相關(guān)粘附因子及管家基因aroA，以GenBank登錄的核苷酸序列，設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)RT-PCR克隆和擴(kuò)增了各粘附因子的核苷酸片段，構(gòu)建含有各自引物擴(kuò)增序列的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性模板，建立檢測(cè)各粘附因子SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法。通過(guò)檢測(cè)粘附試驗(yàn)中SS2各菌株粘附因子轉(zhuǎn)錄水平，初步闡明SS2粘附因子轉(zhuǎn)錄水平確實(shí)影響細(xì)菌粘附細(xì)胞的能力，為后續(xù)研究SS2粘附能力及致病機(jī)制提供研究

6、平臺(tái)。
　　 3.豬IL-1β、IL-18、IL-8、IL-10、L-12及β-actin SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及SS2對(duì)3D4豬肺泡巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的體外mRNA轉(zhuǎn)錄分析依據(jù)GenBank中登錄的各豬細(xì)胞因子及管家基因β-actin的核苷酸序列，設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)RT-PCR從3D4豬肺泡巨噬細(xì)胞系中克隆和擴(kuò)增了上述三個(gè)因子的核苷酸片段，構(gòu)建含有各自引物擴(kuò)增序列的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性模板(IL