人KininogenD5和TRAIL融合蛋白的克隆表達和生物學活性研究.pdf

1、20世紀70年代初，F(xiàn)olkmall首先提出“腫瘤的生長和轉移都依賴于新生血管的生成”的論點。到目前為止，已經(jīng)證實了腫瘤的生長和轉移必須有新生血管提供氧氣和養(yǎng)料，而血管新生是在原有的毛細血管或微靜脈基礎上，通過內皮細胞的增殖和遷移，從先前存在的血管處以芽生或非芽生的形式生成新的毛細血管，是胚胎發(fā)育時期和女性月經(jīng)周期子宮內膜周期性剝脫修復時血管形成的主要方式，同時也是病理狀態(tài)下比如損傷后修復主要方式。血管新生主要受兩方面因素的調控，一是促

2、血管形成因子的增加，二是抑制血管形成因子的減少。在生理狀態(tài)下血管生成促進因子和抑制因子之間達到一個平衡，但是在腫瘤的增大和轉移的過程中，血管新生促進因子占據(jù)了優(yōu)勢，因此，如果抑制新生血管的形成，腫瘤細胞將發(fā)生凋亡或壞死，這就為抗腫瘤的治療開辟了新的思路。 目前，有多種抑制血管新生的藥物用于抗腫瘤治療的研究，單鏈的高分子量激肽原(HK)是一個分子量約為120kDa的球蛋白，在血漿中的濃度約為90μg/ml，從結構上來說，HK 由六

3、個結構域組成，其中1-3構成它的重鏈，5-6構成它的輕鏈，重鏈和輕鏈之間由包含有一個九肽的緩激肽的第四結構域相連。在血漿的激肽釋放酶的作用下，釋放出一個九肽的緩激肽以后就形成了一個由約62 kDa的重鏈和約56 KDa的輕鏈形成的雙鏈分子，重鏈和輕鏈之間由位于第10位和596位之間的單一的二硫鍵連接。激肽釋放酶進一步在該雙鏈的第419位精氨酸和420位的賴氨酸之間酶切，使短鏈縮短為約46 KDa大小，這樣形成的雙鏈高分子量激肽原被稱為活

4、化的高分子量的激肽原(HKa)。HK和Hka在結構上都有第五結構域的富含組氨酸區(qū)域，第五結構域通過該區(qū)域與Zn<'2+>結合，通過電鏡的觀察發(fā)現(xiàn)隨著HK活化成為Hka后，它的構象發(fā)生了明顯的改變，其最主要的特征就是它的第五結構域暴露，而第五結構域的暴露使Hka獲得一個新的生物學活性，從而使它可以和活化的血管內皮細胞表面的尿激酶纖溶酶原激活受體(uPAR)特異的結合，從而使活化的內皮細胞去黏附而誘導內皮細胞的凋亡來抑制血管的新生。目前，對

5、于Hka誘導內皮細胞凋亡，抑制血管新生的作用機制已經(jīng)得到了比較明確的研究，對于其有功能的活性片段也已經(jīng)進行了鑒定，但是對于單純的用Hka來進行抗腫瘤的治療仍存在不少的問題，動物實驗顯示，單純用Hka來進行治療會發(fā)現(xiàn)藥物的劑量較大，而且起效所需時間長，因此，本課題通過將HK的活性片段D5<'[8]>和具有強大的抗腫瘤活性、毒副作用小的腫瘤壞死因子相關誘導凋亡配體TRAIL<'[13]>的活性片段進行融合，得到具有雙功能作用的融合蛋白，特異

6、性的殺傷腫瘤細胞和腫瘤新生血管的內皮細胞。 本課題運用基因工程技術，分別獲得KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>片段，分別鑒定其活性后，通過重組PCR技術，用氨基酸連接臂將兩個活性片段雙向重組連接，獲得了KininogenD5<,60-148>—TRAIL<,114-281>(KT)和TRAIL<,114-281>—KininogenD5<,60-148>(TK)，將得到的重組蛋白進行活性鑒定

7、，發(fā)現(xiàn)KT具有較強的抗腫瘤細胞和殺傷新生血管內皮的作用，而TK活性很小，在此基礎上還初步探討了KT誘導細胞凋亡的機制以及KT的抗瘤譜。 一、KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>的克隆、表達與活性鑒定 我們采用PCR技術分別獲得KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>基因片段，分別構建pMAL-KininogenD5<,60-148>(PKD5)和pMAL

8、-TRAIL<,114-281>(PT)的重組質粒，將重組質粒導入大腸桿菌E．Coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導表達及2.5 L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)，親和層析，過濾，-80℃保存?zhèn)溆谩?大腸桿菌表達的融合蛋白MBP/KD5和MBP/T在E．Coli BL21中的菌體總蛋白含量分別為25％和 23％，誘導后得到了有效的表達，超聲破菌后，融合蛋白最主要在上清表達，經(jīng)Amylose Resin親和柱純化后，獲得了純化的MBP/KD

9、5和MBP/T融合蛋白，純化后純度分別達95％和 93％(Syngene掃描分析)，經(jīng)Werstern B10t鑒定在52 kDa和62 kDa處得到相應的融合蛋白表達條帶。 用上述純化的PKD5和PT分別在ECV304和人胰腺導管上皮細胞SWl990上進行活性鑒定，在geltalin和fibranectin包被以及在VEGF存在的情況下，PKD5對內皮細胞有明顯的抑制作用，如果沒有Zn<'2+>存在的情況下，ED<,50>為1

10、0μg/ml，當Zn<'2+>濃度為10nmol/L時，ED<,50>為50ng/ml；PT對SW1990有明顯的殺傷作用，ED<,50>為25 ng/ml。PT對于腫瘤細胞有明顯的誘導凋亡的作用，是很好的抗腫瘤藥物；通過管狀結構形成實驗，PKD5可以明顯的抑制體外管狀結構的形成，因此具有潛在的抗腫瘤活性。 二、利用重疊PCR技術將KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>雙向融合表達 第一

11、部分的研究結果表明了KD5和TRAIL的活性片段都具有生物學活性，因此，我們將兩者的活性片段進行融合得到一種新型的融合蛋白。這種新型融合蛋白的靶向能力是利用配體KininogenD5<,60-148>和活化的血管內皮細胞上高表達的受體uPAR之間高度特異相互作用的特性和TRAIL<,114-281>和腫瘤細胞表面的死亡受體特異性結合的特性。因此，KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>融合蛋白具有靶向殺傷

12、腫瘤細胞的能力，我們利用原核表達系統(tǒng)制備該融合蛋白。 首先，我們利用重組PCR技術，合成KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>的雙向融合基因KT和TK，Kininogen和TRAIL之間通過氨基酸連接臂相連，將融合基因分別克隆NpMAL-c2載體中，獲得重組表達質粒pMAL－KT和pMAL－TK，轉化E.coli BL21 (DE3)。SDS-PAGE分析顯示，在IPTG誘導下，人pMAL－KT

13、和pMAL－TK融合基因獲得了有效表達，表達量約占菌體總蛋白質的25％左右，主要以可溶的形式表達，經(jīng)Amylose Resin親和柱純化后，得到了純度在95％以上的純化蛋白MBP/KT和MBP/TK，利用純化蛋白對內皮細胞ECV304和人胰腺膽管上皮細胞癌細胞SW1990的細胞毒實驗，結果表明MBP/KT具有良好的雙功能活性，對ECV304細胞的IC<,50>為30 ng/ml，對于SW1990細胞的ED<,50>為5 ng/ml，而M