MMPs介導(dǎo)的腫瘤靶向性rhTNF-α融合蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建、表達(dá)純化及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、[目的]
　　 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種多功能細(xì)胞因子，其最顯著的特征是在體內(nèi)外直接殺傷腫瘤細(xì)胞，是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的抗腫瘤生物制劑。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，應(yīng)用基因工程手段制備高效低毒的hTNF-α突變體和其腫瘤靶向性的TNF-α融合蛋白呈現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。本課題根據(jù)腫瘤組織一般高分泌MMPs特點(diǎn)，構(gòu)建MMPs介導(dǎo)的腫瘤靶向性rhTNF

2、-α融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒，使融合蛋白特異性地靶向于腫瘤組織，腫瘤組織高濃度的MMPs水解其底物序列，暴露出hTNF-α受體結(jié)合部位。hTNF-α與其受體結(jié)合后，誘發(fā)一系列的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。
　　 [方法]
　　 1.構(gòu)建pET-42a(+)-foldon載體合成含有foldon序列的引物，對(duì)pET-42a(+)質(zhì)粒進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物和pET-42a(+)質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化。篩選陽(yáng)性重

3、組子并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定、雙酶切鑒定、PCR鑒定和DNA測(cè)序分析。
　　 2.構(gòu)建四種重組質(zhì)粒對(duì)本課題組構(gòu)建好的pET-32a(+)-collagen-MMP1，8a-hTNF-α、pET-32a(+)-collagen-MMP1，8b-hTNF-α、pET-32a(+)-collagen-MMP2，9a-hTNF-α和pET-32a(+)-collagen-MMP2，9b-hTNF-α四種克隆質(zhì)粒用相對(duì)應(yīng)的引物分別進(jìn)行PC

4、R，得到的PCR產(chǎn)物片段中分別含有MMP1-hTNF-α、MMP8-hTNF-α、MMP2-hTNF-α、MMP9-hTNF-α，對(duì)PCR產(chǎn)物和pET-42a(+)-foldon質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化。篩選陽(yáng)性重組子并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定、雙酶切鑒定、DNA測(cè)序分析。
　　 四種重組質(zhì)粒質(zhì)粒分別命名為：pET-42a(+)-foldon-MMP1-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP8-hTNF-α

5、、pET-42a(+)-foldon-MMP2-hTNF-α和pET-42a(+)-foldon-MMP9-hTNF-α；
　　 3.蛋白表達(dá)產(chǎn)物的鑒定及條件的優(yōu)化用終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。在蛋白基本表達(dá)的基礎(chǔ)上，對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度及表達(dá)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，按照Novagen公司蛋白提取試劑盒(BugBuster Protein Extraction Reagent)方法

6、進(jìn)行提取，分別收集上清和沉淀中融合蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，然后利用Bandscan軟件分析，確定融合蛋白的可溶性表達(dá)條件。
　　 4.蛋白純化
　　 1)按照Novagen公司GST-Bind Resin試劑盒方法純化融合蛋白，SDS-PAGE鑒定融合蛋白的純化產(chǎn)物。
　　 2)純化蛋白總含量的測(cè)定。
　　 按Bradford酶標(biāo)板蛋白測(cè)定法檢測(cè)純化產(chǎn)物的含量。
　　 3)用凝血因子(Fa

7、ctor Xa)切除載體標(biāo)簽5.基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1、MMP-8和MMP-2、MMP-9)對(duì)融合蛋白的去封閉效果研究分別用MMP-1、MMP-8、MMP-2和MMP-9酶切相對(duì)應(yīng)的融合蛋白，SDS-PAGE鑒定酶切條帶。
　　 6.融合蛋白生物學(xué)活性的初步研究以hTNF-α標(biāo)準(zhǔn)品為參照，對(duì)帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白(即GST-foldon-MMP1-hTNF-α)、切除GST標(biāo)簽的融合蛋白(即foldon-MMP1-hTNF

8、-α)、經(jīng)MMP1酶切的融合蛋白(即rhTNF-α)，利用MTT法檢測(cè)融合蛋白的細(xì)胞毒性。
　　 [結(jié)果]
　　 1.成功構(gòu)建了pET-42a(+)-foldon-MMP1-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP8-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP2-hTNF-α和pET-42a(+)-foldon-MMP9-hTNF-α四種質(zhì)粒；
　　 2.確立了pET-42a(+)-

9、foldon-MMP1-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP8-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP2-hTNF-α和pET-42a(+)-foldon-MMP9-hTNF-α四種質(zhì)粒在大腸桿菌Rosetta2(DE3)的表達(dá)條件，實(shí)現(xiàn)了四種rhTNF-α融合蛋白的高效、可溶性表達(dá)。
　　 3.確定了融合蛋白的純化方案，成功切除了融合蛋白上的載體標(biāo)簽。
　　 4.初步驗(yàn)證了基質(zhì)金屬