鴨IFNα-IFNγ、IFNα-IL18基因的融合表達(dá)及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、干擾素（interferon，IFN）是一類在同種細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子。國際干擾素命名委員會根據(jù)干擾素的抗原特性和分子結(jié)構(gòu)的差異，將干擾素分為3個型。α干擾素（IFN-α）屬Ⅰ型干擾素，主要參與機(jī)體抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)過程。γ干擾素（IFN-γ）屬于Ⅱ型干擾素，IFN-γ可誘導(dǎo)病毒感染的細(xì)胞表達(dá)病毒抗原，增加免疫系統(tǒng)識別和殺傷感染細(xì)胞的能力，還可作為免疫佐劑參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，其抗病毒作

2、用弱于Ⅰ型干擾素。白細(xì)胞介素18（interleukin-18，IL-18）是由單核巨噬細(xì)胞分泌，IL-18能夠誘導(dǎo)IFN-γ基因表達(dá)，也可誘導(dǎo)諸如TNF-α、IL-2及GM-CSF等多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生和表達(dá)，在細(xì)胞免疫過程中發(fā)揮著重要作用。以往關(guān)于鴨干擾素與白細(xì)胞介素的研究，主要是針對單個干擾素或白介素，將鴨IFN-α、IFN-γ和IFN-α、IL-18進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)后，其聯(lián)合抗病毒的效果尚不清楚。本研究應(yīng)用重疊延伸PCR（gene s

3、plicing by overlapextension，SOE-PCR）的方法，分別將鴨 IFN-α、IFN-γ及 IFN-α、IL-18基因進(jìn)行融合，利用BL21原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，分別在體內(nèi)和體外檢測融合蛋白的生物學(xué)活性，并與單個鴨 IFN-α、IFN-γ和 IL-18重組蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性比較，目的在于研究出易于生產(chǎn)，成本低，活性高，具有疊加抗病毒功能的重組復(fù)合抗病毒制劑。具體分為4個部分：
　　1.本研究參照GenBan

4、k上發(fā)表的鴨IFN-α、IFN-γ和IL-18基因序列分別設(shè)計了3對引物，以抽提的鴨外周血淋巴細(xì)胞DNA為模板，分別擴(kuò)增出去除信號肽后的目的基因。應(yīng)用SOE-PCR的方法分別將鴨IFN-α、IFN-γ及IFN-α、IL-18基因進(jìn)行融合，然后，將各基因連接到pET-32a（+）原核表達(dá)載體上，構(gòu)建出鴨IFN-α、IFN-γ、IL-18、IFNα-IFNγ和IFNα-IL18基因的原核表達(dá)載體。
　　2.將各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21原

5、核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行原核表達(dá)。將存在于包涵體中的表達(dá)蛋白用尿素變性后，使用鎳親和層析的方法純化蛋白，后利用梯度透析法進(jìn)行復(fù)性，并進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western blot鑒定。
　　3.采用微量細(xì)胞病變抑制法在VSV（水泡性口炎病毒）/DEF、AIV（禽流感病毒）/DEF及DPV(鴨瘟病毒)/DEF系統(tǒng)上檢測原核表達(dá)蛋白rDuIFNα-DuIFNγ和rDuIFNα-DuIL18的抗病毒活性，同時以rDuIFN-α、rDuIFN

6、-γ和rDuIL-18作為對照。結(jié)果表明：rDuIFNα-DuIFNγ和rDuIFNα-DuIL18蛋白均有顯著的抗VSV、AIV和DPV活性，在DEF上，其抗病毒活性明顯優(yōu)于單一rDuIFN-α、rDuIFN-γ和rDuIL-18重組蛋白，達(dá)到105～108 U/mg，其中，融合蛋白rDuIFNα-DuIFNγ的抗病毒活性高于rDuIFNα-DuIL18。單一重組蛋白rDuIFN-α、rDuIFN-γ和rDuIL-18中，rDuIFN

7、-α的活性最高，達(dá)到104～105 U/mg，約為rDuIFN-γ的2～10倍，rDuIL-18的抗病毒活性最低。
　　4.分別檢測各重組蛋白在北京鴨體內(nèi)抗AIV和DPV作用。結(jié)果表明，融合蛋白rDuIFNα-DuIFNγ具有較好的抗病毒效果，可有效減少排毒，對AIV和DPV感染動物的保護(hù)率分別為100％和90%，而單一重組蛋白對感染動物的保護(hù)率多在90%以下，證明rDuIFNα-DuIFNγ可有效提高攻毒保護(hù)率，其抗病毒作用優(yōu)于