河蚌作為水體人類腸道病毒污染指示物的研究.pdf

1、目的：利用熒光實時定量PCR檢測水環(huán)境中貝類組織中的人類腸道病毒含量，初步探索該病毒量與水體中病毒含量的關系。
　　 方法：利用PEG（聚乙二醇）沉淀法沉降貝類組織中的人類腸道病毒，沉淀物接種至Vero細胞中觀察是否出現CPE 反應。沉淀病毒之前的洗脫法分為甘氨酸洗脫法（傳統(tǒng)的）和甘氨酸-蘇氨酸洗脫法（新提出的），空斑法檢測兩種洗脫-沉淀方法的回收率。同期所采的水樣（濾膜法）經牛肉膏洗脫再經PEG沉淀。貝類樣品及水樣均用TRIz

2、ol 法和試劑盒法提取腸道病毒RNA，根據OD260/280 值以及吸光度全面掃描的測定結果分析兩種提取方法所提RNA的質量差別。PCR反應中使用人類腸道病毒通用引物，提取RNA后進行普通RT-PCR反應。在對貝類樣品及水樣進行絕對定量之前，需制備用來制作標準曲線的熒光定量質粒標準品。本實驗中質粒菌為實驗室利用T-A 克隆法自行制備（含有腸道病毒PCR產物目的片段）。通過菌液PCR和質粒PCR反應對質粒菌進行篩選并提取出純度符合要求的質

3、粒，檢測DNA濃度換算出拷貝數進行熒光定量PCR反應。根據熔解曲線判斷四組引物濃度（a組：300 nM /300nM，b組：200 nM /200 nM，c組：100 nM /100 nM，d組：50 nM /50 nM）的引物二聚體的形成情況，選擇合適的引物濃度。對標準品進行10倍系列稀釋，通過觀察擴增曲線等選擇合適的質粒標準品的稀釋度范圍制備標準曲線。進行熒光定量PCR反應，檢測貝類組織樣品及水樣中的腸道病毒含量。
　　 結

4、果：貝類組織的沉淀物接種至Vero細胞，出現明顯的CPE 反應。兩種洗脫方法，甘氨酸洗脫法（全貝）的回收率為19.6％，甘氨酸-蘇氨酸洗脫法（貝類腸道）的回收率為13.1％，選擇甘氨酸洗脫法進行后續(xù)實驗。TRIzol 法和試劑盒法提取RNA的OD值260/280 比較結果差異有統(tǒng)計學意義（t 值=8.53，P 值<0.05），全面掃描顯示TRIzol法中殘留的小分子鹽類物質（OD=230 nm）較多，而試劑盒法的波峰集中于核酸吸收峰處（

5、OD=260 nm），試劑盒法提取RNA 純度較好。貝類組織及水樣經過普通PCR反應，凝膠電泳均顯示明顯的目的條帶片段，用PEG 法提取腸道病毒較成功。菌液PCR和質粒PCR反應均顯示明顯的目的條帶，OD 值260/280 均大于1.8，提取的質粒DNA較純。優(yōu)化后的引物濃度為100 nM /100 nM，選擇稀釋度范圍為103~107的質粒標準品制作標準曲線進行實時定量PCR反應，貝類樣品中檢測出的腸道病毒拷貝量最高為1.12×103