基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑對心肌重構(gòu)的影響.pdf

1、背景及目的
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)是由許多結(jié)構(gòu)和功能相似的中性蛋白酶組成的多基因內(nèi)源性鋅依賴性酶家族,它由血管平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生,可降解除多糖以外所有的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)成分。目前已發(fā)現(xiàn)的MMPs家族成員有20多種,根據(jù)其結(jié)構(gòu)及功能的不同可分為四大類:第一類為膠原酶(MMP-1,8,13等),其主要水

2、解底物是纖維類膠原,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原；第二類為明膠酶(MMP-2,9),主要迅速水解變性膠原蛋白及和明膠蛋白；第三類為基質(zhì)水解酶類(MMP-3,10,11等),水解Ⅲ,Ⅳ型膠原和蛋白多糖,明膠和糖蛋白；第四類為結(jié)構(gòu)與功能比較特殊的MMPs(MMP-7,12,19,20,23,26等),其除能降解幾種ECM成分外,還能激活其他MMPs?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(Tissue inhibitors ofmetalloproteinase,TI

3、MPs)是MMPs的內(nèi)源性特異性抑制物,分泌MMPs的細(xì)胞同時(shí)也分TIMPs,TIMPs家族里共有四個(gè)成員,分別為TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4。TIMPs主要具有兩方面功能:它們對不同的MMPs具有不同的抑制強(qiáng)度,通常TIMPs以1:1的分子比例與激活的MMPs形成高親和力復(fù)合物,并通過封閉MMPs的催化區(qū),從而抑制ECM的降解。此外,TIMPs還有促進(jìn)有絲分裂、抑制血管生成和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用。
　　

4、 目前針對MMPs在心房顫動(dòng)及心肌梗死的發(fā)病、發(fā)展中所起的作用及治療研究尚不多,研究主要集中在以下幾個(gè)方面:①合成MMPs的特殊抑制劑,但主要集中于防治腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移；②利用重組蛋白或病毒載體基因轉(zhuǎn)運(yùn)技術(shù)給予內(nèi)源性抗蛋白酶劑,或提高體內(nèi)TIMPs的分泌；③根據(jù)MMPs的表達(dá)及酶活性調(diào)控機(jī)制,開發(fā)具有調(diào)控MMPs/TIMPs平衡的藥物。在本研究中,我們收集了50例風(fēng)濕性心臟病患者以及40例冠心病患者的臨床資料及心肌標(biāo)本,進(jìn)行免疫組化染色

5、檢測及實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),研究MMPs及TIMPs與心肌重構(gòu)的相關(guān)性,進(jìn)一步深入分析心肌重構(gòu)發(fā)病機(jī)制以及與臨床特征的關(guān)系。
　　 材料與方法
　　 1.病人及標(biāo)本收集:選取2007年9月至2009年5月期間在我院接受人工心臟二尖瓣置換術(shù)的風(fēng)濕性心臟病患者共50例,男28例,女22例,年齡26-66歲,分為竇性心律組(SR)20例,心房纖顫組(AF)30例。有下列情況之一者不納入本研究:①年齡小于20歲或大于66歲者；

6、②合并有感染性心內(nèi)膜炎者；③合并有高血壓、糖尿病、冠心病、甲狀腺功能亢進(jìn)、心肌病、慢性肺源性心臟病或嚴(yán)重肝腎功能不全者；④非風(fēng)濕性心臟病而接受心臟瓣膜置換術(shù)者:⑤風(fēng)濕性心臟病非二尖瓣瓣膜置換術(shù)者；⑥臨床有風(fēng)濕活動(dòng)征象或發(fā)熱者。并同期選取接受冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)的冠心病患者共40例,男25例,女15例,年齡40-65歲,分為心肌梗死組(MI)22例,不穩(wěn)定型心絞痛組(UA)18例。術(shù)前行冠狀動(dòng)脈造影檢查,造影結(jié)果顯示在MI組中,9例為左主干病

7、變超過50％(41％),8例為三支冠脈血管病變(36％),5例為雙支冠脈血管病變(23％)；UA組中8例為左主干病變超過50％(44％),6例為三支冠脈血管病變(33％),4例為左前降支近段嚴(yán)重狹窄(23％)。所有患者均符合行冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)手術(shù)指證,并排除合并肝腎功能不全、肺纖維化、骨代謝性疾病、嚴(yán)重糖尿病、全身免疫性疾病、感染、風(fēng)濕性疾病及惡性腫瘤等。登記各研究對象的相關(guān)臨床資料,包括年齡、性別、身高、體重、合并的其他疾病、用藥情況等

8、,并于術(shù)前行心電圖、超聲心動(dòng)圖、胸片等檢查。所有患者心功能均為Ⅱ-Ⅲ級(NYHA分級)。術(shù)前所有患者均簽署知情同意書。在開胸建立體外循環(huán)之前取患者右心耳標(biāo)本約100mg,除去血液和脂肪組織后立刻放入液氮中保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.免疫組化染色檢測:采用鏈霉菌親生物素蛋白-過氧化物酶連接法(streptavidin peroxidase conjugated method,SP法),滴加適量稀釋的小鼠抗人MMP-1、MMP-3、MMP

9、-7、MMP-9及TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4單克隆抗體與特異性抗原結(jié)合形成抗原.抗體復(fù)合物,之后再使用生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合后用DAB顯色劑顯色,陽性結(jié)果為胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒,表明在心肌中為彌漫陽性表達(dá)。在光鏡下觀察,并在同等光照條件下拍攝數(shù)碼照片,運(yùn)用Image-pro plus軟件進(jìn)行圖像定量分析,計(jì)算陽性單位(PU值)。
　　 3.熒光定量PCR反應(yīng):采用Trizol一步法提取組織RNA,測定各

10、RNA樣品的OD260、OD280,并計(jì)算RNA濃度,將RaNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反轉(zhuǎn)錄步驟嚴(yán)格按TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒說明進(jìn)行,進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng),設(shè)計(jì)并合成引物,分別利用內(nèi)參(GAPDH)引物和各指標(biāo)引物進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng),以檢驗(yàn)?zāi)０錭DNA與引物,再進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)參數(shù)等均按TaKaRa SYBR(R)Premix EX Ta

11、qTM(Perfect RealTime)試劑盒說明進(jìn)行。數(shù)據(jù)按照以下公式分析,計(jì)算每個(gè)樣品中各指標(biāo)相對于GAPDH的相對百分含量,即(指標(biāo)/GAPDH)*100％XO1/XO2=2-(CT1-CT2)=2-△CT
　　 4.統(tǒng)計(jì)分析:所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以p<0.05為差異有顯著性。
　　 討論
　　 心肌細(xì)胞外基質(zhì)是由纖維膠原、

12、基質(zhì)膜蛋白、蛋白聚糖和具有生物活性的信號分子所組成的,是心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要組成成分,且具有細(xì)胞間信息傳遞、協(xié)調(diào)舒縮功能、維持心肌細(xì)胞及心肌纖維的排列、限制心肌細(xì)胞過度拉長的作用。心肌細(xì)胞外基質(zhì)的改變還可造成心肌收縮和有效的射血之間失去協(xié)調(diào)性,并且失去了對心臟幾何形狀的支持作用,致使泵功能受損。
　　 MMPs是一組與鋅結(jié)合的分解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶家族,至今發(fā)現(xiàn)已有20余種,按作用底物分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)水解酶、膜型酶等4種,

13、參與胚胎正常發(fā)育及組織重塑,參與人體許多病理和生理過程。TIMPs是MMPs的內(nèi)源性特異性抑制劑,分為4型,二者之間的相互作用及動(dòng)態(tài)平衡中維持心臟正常形狀和心功能中起著重要的作用。已有研究表明,MMPs及TIMPs的表達(dá)及活性異常參與心肌結(jié)構(gòu)的重構(gòu)。
　　 目前國內(nèi)外對MMPs及TIMPs在心血管疾病中的表達(dá)水平報(bào)道不一,且多數(shù)研究集中在檢測血清中二者的表達(dá)水平或利用動(dòng)物模型來推測MMIPs及TIMPs在人類心臟疾病患者心肌內(nèi)的

14、表達(dá)。在我們的研究中使用人類心肌活檢的方式,分別選取四類基質(zhì)金屬蛋白酶中的各一種及所有的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑來進(jìn)行探討基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在風(fēng)濕性心臟病房顫患者及心肌梗死患者心肌的表達(dá)情況,具有全面性及概括性。由于風(fēng)濕性心臟病瓣膜病變的不同及心力衰竭的程度會(huì)影響心房纖維化程度和房顫的發(fā)生,為此本研究所選病例均為二尖瓣病變患者,且各組中瓣膜病變差異無顯著性,各組病例中左室射血分?jǐn)?shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示,風(fēng)濕性心臟病房顫患

15、者與竇性心律患者相比較,左右心房內(nèi)徑明顯擴(kuò)大,差異具有顯著性。說明房顫導(dǎo)致心肌組織發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化,房腔擴(kuò)大,心肌僵硬度增加。在對冠心病患者的研究中發(fā)現(xiàn),心肌梗死患者與不穩(wěn)定型心絞痛患者相比較,左右心房內(nèi)徑及左室舒張內(nèi)徑明顯擴(kuò)大,左室射血分?jǐn)?shù)降低,差異具有顯著性,說明心肌梗死患者心肌組織發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化,心房腔及心室腔均擴(kuò)大,心肌僵硬度增加,心肌順應(yīng)性下降,心功能受損。本研究使用免疫組織化學(xué)染色法,并使用PU值定量計(jì)算各MMPs及TIMPs

16、的表達(dá)。再使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法更準(zhǔn)確的測量各MMPs及TIMPs的表達(dá),結(jié)果顯示在風(fēng)濕性心臟病房顫患者心肌組織中MMP-3、MMP-7、MMP-9及TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4表達(dá)明顯增加,雖然MMP-1表達(dá)在兩組患者中差異無顯著性,但總體數(shù)值仍然是呈增加趨勢,在心肌梗死患者心肌組織中MMP-3、MMP-9及TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4表達(dá)明顯增加,雖然MMP-1、MMP-7表達(dá)

17、在兩組患者中差異無顯著性,但總體數(shù)值仍然是呈增加趨勢。提示在風(fēng)濕性心臟病心房纖顫及冠心病心肌梗死患者的心肌組織中,MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-9及TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4的表達(dá)增高,使得心肌細(xì)胞外基質(zhì)降解,導(dǎo)致心肌細(xì)胞拉長,心房壁變薄、心房擴(kuò)大,正常細(xì)胞成分減少,基質(zhì)成分增加,心肌廣泛纖維化,最終促進(jìn)心房組織重構(gòu)的發(fā)生與維持。說明MMPs表達(dá)活性增強(qiáng)可使ECM合成與降解失衡,MMPs、TIM