苦豆堿通過(guò)抑制PI3K-AKT-mTOR通路減輕小鼠腎臟缺血再灌注的損傷.pdf

1、目的：研究苦豆堿對(duì)腎臟缺血再灌注的保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。
　　方法：通過(guò)使用動(dòng)脈夾夾住小鼠雙側(cè)腎蒂45分鐘然后再松開(kāi)動(dòng)脈夾的方法建立小鼠腎臟缺血再灌注模型。18只C57/B6小鼠隨機(jī)分為三組：
　　(1)缺血再灌注—苦豆堿組，缺血再灌注前連續(xù)8天灌胃給與苦豆堿（Q1962,卡邁舒，上海）預(yù)處理，苦豆堿溶解于含10％冰乙酸的生理鹽水中（2.5mg/ml），給藥濃度為50mg/kg；第9天行缺血再灌注手術(shù)，其中缺血45min

2、，再灌注24h后犧牲小鼠。
　　(2)缺血再灌注—介質(zhì)組：缺血再灌注前給予等量的含10%冰乙酸的生理鹽水預(yù)處理；第9天行缺血再灌注手術(shù)，其中缺血45min，再灌注24h后犧牲小鼠。
　　(3)假手術(shù)組：類似缺血再灌注手術(shù)流程但不使用動(dòng)脈夾，給予等量的含10%冰乙酸的生理鹽水預(yù)處理，再灌注24小時(shí)后犧牲小鼠。收集血清和腎臟組織樣品。通過(guò)血清檢測(cè)肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平以反映腎功能。HE和PAS染色用來(lái)評(píng)價(jià)腎臟損傷程度

3、，包括：腎小管壞死，刷狀緣和基底膜的完整程度以及管型形成的多少。腎臟組織切片進(jìn)行MPO和F4/80的免疫組織化學(xué)染色以定量分析中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)。IL-1β，IL-10和 IFN-γ通過(guò)RT-PCR來(lái)檢測(cè)。腎小管上皮細(xì)胞的凋亡是通過(guò)TUNEL檢測(cè)試劑盒以及Caspase3的蛋白表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)。SOD和MDA的水平和活性通過(guò)南京建成生物研究所的SOD和MDA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。PI3Kp85，Akt，mTOR，NFκBp65，c-

4、fos和Bcl2的表達(dá)水平和活性通過(guò)Western Blot來(lái)檢測(cè)。NFκBp65和AP-1（c-fos）的DNA結(jié)合活性通過(guò)凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)來(lái)檢測(cè)。
　　結(jié)果：與缺血再灌注—介質(zhì)組相比，缺血再灌注—苦豆堿組的小鼠腎臟功能和形態(tài)學(xué)改變明顯受到保護(hù)；中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)情況也明顯減少；同時(shí)促炎細(xì)胞因子IL-1β和IFN-γ的水平也相應(yīng)減少，而抗炎因子IL-10則增多。苦豆堿預(yù)處理的缺血再灌注小鼠比缺血再灌注對(duì)照組

5、小鼠的腎小管上皮細(xì)胞凋亡減少；SOD的水平則相應(yīng)增加，這表明ROS的聚集減少；總的PI3Kp85，Akt,mTOR和NFκB p65的蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差別，但是磷酸化的PI3Kp85，Akt,mTOR和NFκB p65的表達(dá)水平則減少，c-fos和Bcl2相應(yīng)增加，NFκB與c-fos的EMSA結(jié)果與Western Blot相似，而假手術(shù)組的所有檢測(cè)指標(biāo)都相應(yīng)正常。
　　結(jié)論：苦豆堿可以減輕小鼠腎臟缺血再灌注損傷，其作用機(jī)制可能