右美托咪定通過PI3K-Akt-HIF-1α信號通路減輕肺缺血再灌注損傷.pdf

1、目的：
　　肺缺血再灌注損傷（LIRI）臨床廣泛存在，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。新型α2受體激動(dòng)劑右美托咪定(DEX)通過抑制全身不同部位α2受體減少突觸前膜交感神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抑制應(yīng)激反應(yīng)等不同且廣泛的臨床藥效特點(diǎn)。
　　磷酸酰肌醇3-激酶(PI3K)是一種脂類激酶，近年來的研究表明，右美托咪定通過PI3K/Akt信號通路上調(diào)HIF-1α表達(dá)減輕大鼠C6細(xì)胞低氧損害。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，研究

2、表明PI3K/Akt信號通路與HIF-1α密切相關(guān)。
　　本研究第一部分通過建立大鼠肺缺血再灌注模型，探討DEX的肺保護(hù)作用，通過檢測PI3K/Akt信號通路的變化進(jìn)一步揭示DEX對LIRI保護(hù)作用的機(jī)制;第二部分通過檢測HIF-1α下游靶基因蛋白的表達(dá)變化，了解DEX對其下游效應(yīng)蛋白的作用;第三部分通過建立人體單肺通氣模型，探討DEX在體保護(hù)作用的機(jī)理，為臨床合理用藥提高理論依據(jù)。
　　方法：
　　1. PI3K/A

3、kt/HIF-1α信號通路在右美托咪定減輕肺缺血再灌注損傷中的作用
　　清潔級雄性大鼠（由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）48只，鼠齡8-10周，體重250-350 g。HX-100E動(dòng)物呼吸機(jī)（中國成都泰盟科技有限公司）。隨機(jī)分為六組:Sham組（Sham group）:不執(zhí)行肺缺血再灌注手術(shù)操作;IR組(IR group); LD組(LD group):1μg/kg右美托咪定組;LD+LY294002組(LDL group):1μg/

4、kg右美托咪定組+0.3mg/kg LY294002; HD組(HD group)1μg/kg右美托咪定組;HDL組(HD group)1μg/kg右美托咪定組+0.3mg/kg。10％水合氯醛4ml/kg腹腔注射麻醉后，尾靜脈穿刺建立液體通路，將大鼠放置于仰臥位，四肢用圖釘固定，氣管切開后采用18G靜脈留置針的針管作為特制氣管導(dǎo)管行氣管內(nèi)插管并連接呼吸機(jī)，左股動(dòng)脈穿刺置管連接有創(chuàng)壓力傳感器行有創(chuàng)測壓及血?dú)夥治?。IR模型建立:大鼠麻醉成

5、功后經(jīng)左側(cè)第Ⅴ肋間切開并逐層游離暴露左肺門，無創(chuàng)血管夾夾閉左肺門60min后松開血管夾恢復(fù)血流再通氣2h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后離斷左肺門，留取左肺-80℃待檢。測定肺組織濕重/干重比;比色法測定SOD活性及MDA含量;石蠟固定并HE染色后光鏡下觀察肺損傷;電鏡下觀察肺組織超微結(jié)構(gòu);RT-PCR法測定HIF-1α mRNA及Akt mRNA表達(dá);Western-blot法檢測HIF-1α和p-Akt表達(dá)。
　　2. 右美托咪定通過上調(diào)HIF1

6、-α及其下游靶基因蛋白減輕肺缺血再灌注損傷
　　清潔級雄性大鼠（由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）48只，鼠齡8-10周，體重250-350 g。HX-100E動(dòng)物呼吸機(jī)（中國成都泰盟科技有限公司）。隨機(jī)分為六組:Sham組（Sham group）:不執(zhí)行肺缺血再灌注手術(shù)操作;IR組(IR group); LD組(LD group):1μg/kg右美托咪定組;LD+LY294002組(LDL group):1μg/kg右美托咪定組+0.3

7、mg/kg LY294002;HD組(HD group)1μg/kg右美托咪定組;HDL組(HD group)1μg/kg右美托咪定組+0.3mg/kg。10％水合氯醛4ml/kg腹腔注射麻醉后，尾靜脈穿刺建立液體通路，將大鼠放置于仰臥位，四肢用圖釘固定，氣管切開后采用自制氣管導(dǎo)管（18G靜脈留置針的針管）行氣管內(nèi)插管并連接呼吸機(jī)，左股動(dòng)脈穿刺置管連接有創(chuàng)壓力傳感器行有創(chuàng)測壓及血?dú)夥治觥R模型建立:大鼠麻醉成功后經(jīng)左側(cè)第Ⅴ肋間切開并逐

8、層游離暴露左肺門，無創(chuàng)血管夾夾閉左肺門60 min后松開血管夾恢復(fù)血供并再通氣2h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后離斷左肺門，留取左肺-80℃待檢。TUNNEL法檢測肺組織凋亡情況;Western-blot法檢測HO-1和BNIP3表達(dá)。
　　3. 右美托咪定上調(diào)HIF-1α及其下游靶基因蛋白保護(hù)單肺通氣肺損傷
　　選取肺癌病人40例，手術(shù)方式為擇期胸腔鏡下肺癌根治術(shù)。入選病人年齡范圍為18～64歲，性別不受限制，美國麻醉醫(yī)師學(xué)會(huì)分級為Ⅱ或Ⅲ級

9、。無糖尿病、血液病及其他代謝障礙性疾病史，排除患有高血壓、慢性阻塞性或（和）限制性肺病等并發(fā)癥，用力肺活量＞80％預(yù)計(jì)值，第一秒呼氣率＞70％預(yù)計(jì)值，術(shù)前2周內(nèi)無吸煙史，預(yù)計(jì)手術(shù)時(shí)間≥1 h且≤4h。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將病人分為2組(n=20):對照組（C組）和右美托咪定組（D組）。術(shù)前常規(guī)禁食、禁飲8h，不用術(shù)前藥。入室后常規(guī)監(jiān)測ECG、無創(chuàng)BP和SpO2，開放右上肢靜脈通路。局麻下行右側(cè)橈動(dòng)脈穿刺置管（肝素抗凝保留），用于采集血樣及

10、監(jiān)測動(dòng)脈有創(chuàng)BP。采用腦電雙頻譜指數(shù)監(jiān)測儀（Aspect公司，美國）監(jiān)測BIS。麻醉誘導(dǎo):靜脈注射咪達(dá)唑侖0.08～0.12 mg/kg、舒芬太尼0.1～1.0μg/kg、依托咪酯0.2～0.6mg/kg和苯磺酸阿曲庫銨0.15 mg/kg，經(jīng)口插入雙腔支氣管導(dǎo)管，男性采用F37氣管導(dǎo)管，女性采用F35氣管導(dǎo)管，并采用纖維支氣管鏡定位，氣管插管后行機(jī)械通氣，吸入氧濃度70％，氧流量1.0～1.5 L/min，VT6～8 ml/kg，RR

11、10～14次/min，吸呼比1∶2，單肺通氣時(shí)RR12～16次/min，其它通氣參數(shù)不變，維持PETCO235～40 mm Hg(1mm Hg=0.133 kPa)。氣管插管成功并定位良好后，D組靜脈輸注右美托咪定0.5μg/kg20 min，然后以0.5μg·kg-1·h-1的速率靜脈輸注至肺葉腫瘤切除后即刻;C組靜脈輸注同等容量生理鹽水。麻醉維持:采用靜脈維持麻醉，靜脈注射丙泊酚調(diào)整其輸注速度范圍為4～8 mg·kg-1·min-1

12、維持BIS值40～50，根據(jù)循環(huán)水平變化間斷靜脈注射舒芬太尼（用量5～10μg/次），調(diào)節(jié)丙泊酚輸注速率，維持HR及MAP的波動(dòng)幅度不超過基礎(chǔ)值的20％。分別于單肺通氣即刻(T1)、單肺通氣60 min(T2)和肺葉腫瘤切除后即刻(T3)，切取擬切除肺葉腫瘤周邊正常肺組織約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小，無菌剪刀剪取大小相近的2份，經(jīng)PBS沖洗，輕壓去水干燥處理。其中一份肺組織液氮保存，采用western blot法檢測肺

13、組織HIF-1α和HO-1的表達(dá)水平;另一份甲醛固定，石蠟包埋用于HE染色。
　　結(jié)果：
　　1. PI3K/Akt/HIF-1α信號通路在右美托咪定減輕肺缺血再灌注損傷中的作用
　　1.1 W/D比值的變化
　　與Sham組比較，IR組W/D升高;與IR組比較，HD組和HDL組W/D降低;與LD組和LDL組比較，HD組和HDL組W/D降低。
　　1.2 肺損傷評分的比較
　　與Sham組比較，IR組

14、肺損傷評分升高;與IR組比較，HD組和HDL組肺損傷評分降低;與LD組比較，HD組和HDL組肺損傷評分減輕。
　　1.3 SOD活性和MDA含量的變化與Sham組比較
　　與Sham組比較，IR組SOD活性降低，MDA含量升高;與IR組比較，HD組和HDL組SOD活性升高，MDA含量降低。
　　1.4 RT-PCR和Western-blot結(jié)果
　　與Sham組比較，IR組AktmRNA、HIF-1αmRNA、H

15、IF-1α和p-Akt表達(dá)下調(diào);與IR組比較，HD組和HDL組AktmRNA、HIF-1αmRNA、HIF-1α和p-Akt表達(dá)上調(diào);與LD組比較，HD組AktmRNA、HIF-1αmRNA、HIF-1α和p-Akt表達(dá)上調(diào)。
　　2. 右美托咪定通過上調(diào)HIF1-α及其下游靶基因蛋白減輕肺缺血再灌注損傷
　　2.1 與Sham組比較，IR組AI升高;與IR組比較，LD、HD組和HDL組AI降低;LD組和HD組AI差別無差異

16、。
　　2.2 與Sham組比較，其余各組HO-1表達(dá)均下調(diào);與IR組比較，LD組、LDL組、HD組和HDL組HO-1表達(dá)上調(diào);與LD組比較，HD組HO-1表達(dá)下調(diào)。
　　2.4 與Sham組比較，IR組、LD組和HD組BNIP3表達(dá)上調(diào);與IR組比較，LDL組和HDL組BNIP3表達(dá)下調(diào)。
　　3. 右美托咪定上調(diào)HIF1-α及其下游靶基因蛋白保護(hù)單肺通氣肺損傷
　　3.1 患者一般情況各指標(biāo)、手術(shù)時(shí)間、單肺通

17、氣時(shí)間、術(shù)中輸液量、出血量和右美托咪定用量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　3.2 與T1時(shí)比較，2組T3時(shí)非通氣側(cè)肺損傷評分升高（P＜0.05）;與C組比較，T3時(shí)非通氣側(cè)肺損傷評分降低（P＜0.05）
　　3.3 HIF-1α和HO-1的比較與T1時(shí)比較，2組T3時(shí)非通氣側(cè)肺組織HIF-1α和HO-1的表達(dá)上調(diào)(P＜0.05);與C組比較，D組T3時(shí)非通氣側(cè)肺組織HIF-1α和HO-1的表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)
　　結(jié)論：

18、
　　1. 大鼠肺缺血再灌注可造成嚴(yán)重肺損傷，加重氧化應(yīng)激損傷
　　2. 右美托咪定可減輕大鼠肺缺血再灌注損傷，減輕氧化應(yīng)激損傷
　　3. 右美托咪定可通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)PI3 K/Akt/HIF-1α信號通路從而減輕肺缺血再灌注肺損傷
　　4. 凋亡參與了肺缺血再灌注損傷過程，右美托咪定可降低凋亡水平
　　5. 右美托咪定通過上調(diào)HO-1并抑制BNIP3表達(dá)抑制凋亡
　　6. 右美托咪定可減輕單肺通