烏索酸抑制PI3K-AKt-mTOR信號通路改善高糖誘導的系膜細胞損傷.pdf

1、前言
　　糖尿病(diabetic)的發(fā)病率近十年在世界范圍內(nèi)迅速增長，糖尿病腎?。╠iabeticnephropathy,DN）是糖尿病的嚴重并發(fā)癥，是導致終末期腎臟病的最常見原因[1]。據(jù)報道30-40％的1型糖尿病患者和5-10％的2型糖尿病患者將最終發(fā)展到終末期腎病(ESRD)[2]。明確一種阻止這種疾病進一步進展的因素，是一項非常重要的任務。
　　腎小球硬化癥是糖尿病腎臟病的典型病理特征[3]。其主要是細胞外基質(zhì)蛋

2、白如膠原蛋白及纖維連接蛋白沉積于系膜細胞間質(zhì)區(qū)，并通過降低腎小球毛細血管濾過面積，導致糖尿病腎臟病的進一步進展[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B（AKt）在基質(zhì)沉積中起重要作用，它參與了高糖條件下系膜細胞Ⅰ型膠原蛋白表達上調(diào)，并作為一種促纖維化細胞因子被認為在糖尿病腎小球硬化方面扮演重要角色[5,6]。
　　PI3K/AKt/mTOR信號通路是一條經(jīng)典信號通路，調(diào)節(jié)著糖代謝、糖原合成、蛋白合成、細胞增殖、細胞肥大以及細

3、胞死亡[7]等許多細胞功能。據(jù)報道PI3K/AKt/mTOR信號通路參與糖尿病腎病的發(fā)病[8-11]。
　　烏索酸(Ursolicacid,UA)是一個來源于植物的五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于漿果、水果及草藥中。具有抗腫瘤、抗肝臟纖維化、降血糖、降血脂及抗動脈粥樣硬化作用[12-16]。烏索酸通過抑制PI3K/AKt信號通路活化，抑制Jurkat細胞（惡性腫瘤細胞）增殖，誘導其凋亡[27]從而起到抗腫瘤作用;同時烏索酸通過降低TG

4、F-βmRNA的表達，抑制人肝星狀細胞(HSC)增殖，誘導其凋亡，從而緩解肝纖維化的惡性循環(huán);在糖尿病腎病研究報道中發(fā)現(xiàn)烏索酸可以通過抑制STAT-3、ERK1/2、JNK通路活化，抑制iNOS過表達，緩解STZ誘導的DN大鼠模型的腎小球肥大和細胞外基質(zhì)增多，延緩DN的進展[17]，但其詳細的保護機制目前尚不明確。
　　本研究用體外培養(yǎng)的人系膜細胞觀察高糖刺激對細胞增殖及活性氧簇產(chǎn)生的影響，觀察PI3K/AKt/mTOR信號通路的

5、變化，明確烏索酸對系膜細胞的保護作用，進一步探討烏索酸保護系膜細胞的分子機制。
　　為此我們設計了以下實驗:
　　目的
　　1.明確PI3K/Akt信號通路是否參與調(diào)節(jié)高糖誘導下的系膜細胞增殖及ECM沉積。
　　2.烏索酸是否對高糖誘導的系膜細胞有保護作用，保護依據(jù)是否通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路活化，抑制系膜細胞增殖，抑制TGF-β1表達及ECM沉積。
　　3.發(fā)現(xiàn)烏索酸新的治療方向，為中草

6、藥治療DN提供新的依據(jù)。
　　方法
　　將體外培養(yǎng)人系膜細胞分為正常葡萄糖組(NG)、甘露醇高滲對照組(Mannitol)、高糖組(HG)、烏索酸干預組(UA)，采用MTT法檢測系膜細胞增殖;PI單染流式細胞儀檢測細胞周期;AnnexinⅤ-FITC雙染流式細胞儀檢測系膜細胞凋亡;DCFH-DA測定系膜細胞活性氧簇產(chǎn)生;Western-blot檢測系膜細胞PI3K/AKt/mTOR信號通路AKt、p-AKt、mTOR、p-m

7、TOR表達，細胞損傷相關蛋白TGF-β1、FN表達，細胞增殖相關蛋白survivin表達，細胞凋亡相關蛋白Bcl-xl、Bax、survivin表達;實時定量PCR法檢測TGF-β1、FN、survivin、Bcl-xl、BaxmRNA表達。
　　結(jié)果
　　1.HG刺激RMC48h，細胞異常增殖(p＜0.05VSNG)，UA以劑量依賴的方式抑制HG誘導的系膜細胞增殖(p＜0.05VSHG)。
　　2.UA促進系膜細胞的

8、早期凋亡(p＜0.05VSHG)，維持細胞正常增殖水平。
　　3.UA抑制高糖誘導的系膜細胞活性氧簇產(chǎn)生，抑制氧化應激，減少系膜細胞損傷。
　　4.UA抑制高糖誘導的系膜細胞AKt、mTOR磷酸化水平(p＜0.05VSHG)，抑制TGF-β1、FN蛋白及mRNA表達(p＜0.05VSHG)，抑制細胞增殖基因survivin蛋白及mRNA表達(p＜0.05VSHG)，抑制抗細胞凋亡基因Bcl-xl蛋白及mRNA表達(p＜0.0