冬青素A經(jīng)PI3K-AKT-mTOR通路抑制血管新生抗肝癌增殖.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界最為常見的惡性腫瘤之一。我國是肝癌的高發(fā)地區(qū)，每年死于肝癌人數(shù)占全球55％，且死亡率仍呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅國人生命健康。進(jìn)入21世紀(jì)以來，盡管基礎(chǔ)與臨床研究獲得重大進(jìn)展，但仍未能逆轉(zhuǎn)肝癌總體預(yù)后差的事實(shí)。因此，尋求一種可安全有效治療肝癌尤其是晚期肝癌的藥物具有重要的臨床意義。
　　冬青素A(Ilexgenin A，IA)為五環(huán)三萜類

2、化合物，提取自冬青科冬青屬植物海南冬青的葉。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)冬青素A具有抗癌活性強(qiáng)、抗瘤譜廣的特點(diǎn)，且原藥材來源廣泛、提取工藝成熟。本論文旨在研究冬青素A的抗肝癌活性、探討抑制血管新生的作用靶點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上闡明冬青素A調(diào)控血管新生的信號分子、抗肝癌增殖的藥理作用。
　　第一章冬青素A抑制H22荷瘤小鼠腫瘤試驗(yàn)
　　方法：
　　H22肝癌細(xì)胞接種于ICR小鼠左側(cè)腋窩皮下建立H22荷瘤小鼠模型，小鼠瘤體積達(dá)0.1 cm

3、3時(shí)隨機(jī)分為模型組（0.5％羧甲基纖維素鈉），陽性對照組（索拉非尼60 mg·kg-1·d-1-1），冬青素A干預(yù)組(15，30，60 mg·kg-1·d-1)，按上述劑量灌胃，連續(xù)2周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束ELISA法檢測血清VEGF;處死小鼠，分離瘤塊，觀察腫瘤組織新生血管分布;稱量瘤重、計(jì)算抑瘤率;組織形態(tài)學(xué)檢測腫瘤組織病理改變;采用免疫組化法檢測腫瘤組織VEGF與CD31表達(dá);透射電鏡觀察肝癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：
　　(1

4、)與模型組（平均瘤重0.50±0.18 g）比較，冬青素A60 mg/kg組平均瘤重0.14±0.06g（抑瘤率:61.83％，p＜0.01）;冬青素A30 mg/kg組平均瘤重0.26±0.23 g(抑瘤率:52.49％，p＜0.05);冬青素A15 mg/kg組平均瘤重0.37±0.20 g（抑瘤率為37.37％，p＞0.05）;
　　(2)冬青素A減少腫瘤表面及組織新生血管;60 mg/kg冬青素A抑制荷瘤小鼠血清VEGF水

5、平(p＜0.01)、減弱腫瘤組織VEGF、CD31表達(dá)（均為p＜0.001）;
　　(3)光鏡下可見冬青素A組腫瘤組織出現(xiàn)不同程度空泡，伴有大片壞死灶;電鏡下觀察冬青素A組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)核濃縮、邊緣化，胞質(zhì)疏松，細(xì)胞膜皺縮。
　　結(jié)論：
　　冬青素A抑制血清VEGF水平，下調(diào)腫瘤組織VEGF及CD31表達(dá)、減少腫瘤新生血管，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制H22荷瘤小鼠腫瘤生長。
　　第二章冬青素A延長H22荷瘤小鼠生存

6、期試驗(yàn)
　　方法：
　　H22肝癌細(xì)胞接種于ICR小鼠左側(cè)腋窩皮下建立H22荷瘤小鼠模型，小鼠瘤體積達(dá)0.1 cm3時(shí)隨機(jī)分為模型組(0.5％ CMC溶液，n=25)，冬青素A干預(yù)組(15，30，60 mg·kg-1·d-1，n=12)，按上述劑量灌胃，連續(xù)2周。干預(yù)期間觀察荷瘤小鼠體重、攝食情況，每3天測量腫瘤體積。干預(yù)4周撤去冬青素A繼續(xù)觀察小鼠存活狀態(tài)至第8周，制作生存曲線。
　　結(jié)果：
　　(1)實(shí)驗(yàn)第1

7、0天，與模型組比較，冬青素A干預(yù)組腫瘤體積明顯減小;
　　(2)實(shí)驗(yàn)第27天，模型組荷瘤小鼠全部死亡，平均生存時(shí)間僅為14.5天。實(shí)驗(yàn)第8周冬青素A60，30 mg·kg-1兩個(gè)劑量組存活率分別為50％，16.7％，平均生存時(shí)間分別為91.8天，42.5天，與模型組比較，差異均具顯著性(p＜0.001，p＜0.001);實(shí)驗(yàn)第48天冬青素A15 mg/kg組小鼠全部死亡，平均生存時(shí)間為27天，與模型組比較，差異具顯著性(p＜0.0

8、01)。
　　(3)模型組荷瘤小鼠攝食、飲水量減少，行為不活躍，體重雖有增長但四肢消瘦。冬青素A改善荷瘤小鼠攝食、飲水量減少現(xiàn)象，行為較活躍，體重增幅不大，亦未出現(xiàn)下降。
　　結(jié)論：
　　冬青素A抑制H22荷瘤小鼠瘤組織生長，有效延長H22荷瘤小鼠生存期。
　　第三章冬青素A抑制血管新生機(jī)制研究
　　方法：
　　體外培養(yǎng)H22肝癌細(xì)胞冬青素A干預(yù)，采用CCK-8法檢測H22細(xì)胞增殖狀態(tài);體外培養(yǎng)人臍靜

9、脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)冬青素A干預(yù)，采用MTT法檢測HUVEC細(xì)胞增殖變化;HUVEC細(xì)胞經(jīng)VEGF(10 ng/ml)誘導(dǎo)24 h，采用Western blot法檢測冬青素A對HUVEC細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)冬青素A對H22細(xì)胞在24 h，48 h和72 h時(shí)的半數(shù)抑制濃度（IC50值）分別為136.8μM,52.79μM和36.14μM;
　　(2)冬青素A對HU

10、VEC細(xì)胞在24 h，48h的IC50值分別為155.7μM和61.67μM;
　　(3)6.25μM冬青素A可下調(diào)HUVEC細(xì)胞內(nèi)p-JAK，p-PI3K，p-AKT，p-mTOR，p-STAT3, p-MAPK蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　冬青素A體外抑制H22肝癌細(xì)胞增殖;冬青素A通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR途徑抑制血管新生。
　　第四章冬青素A對H22荷瘤小鼠安全性初步評估
　　方法：
　

11、　H22肝癌細(xì)胞接種于ICR小鼠左側(cè)腋窩皮下建立H22荷瘤小鼠模型，小鼠瘤體積達(dá)0.1 cm3時(shí)隨機(jī)分為模型組（0.5％羧甲基纖維素鈉），陽性對照組（索拉非尼60 mg·kg-1·d-1），冬青素A干預(yù)組(15，30，60 mg·kg-1·d-1)，按上述劑量灌胃，連續(xù)2周。期間每天監(jiān)測小鼠活動(dòng)狀態(tài)，稱量體重、攝食量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取血檢測小鼠血液生化參數(shù);處死小鼠，分離重要臟器（心、肝、脾、肺、腎），稱量并計(jì)算重要臟器系數(shù)，H&E染色檢測其

12、形態(tài)變化;采用RT-PCR法測定肝臟細(xì)胞色素P450酶活性。
　　結(jié)果：
　　(1)與模型組比較，冬青素A60，30 mg/kg組均可下調(diào)肝臟CYP1A2，CYP2E1，CYP3A11 mRNA表達(dá);
　　(2)冬青素A組荷瘤小鼠血液WBC，RBC，Hb，MPV及PLT等參數(shù)均在正常范圍，與模型組比較，差異均無顯著性（均為p＞0.05）;
　　(3)與模型組比較，冬青素A組荷瘤小鼠心、肝、脾、肺、腎的臟器系數(shù)均無