中波紫外線誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 紫外線是與人體皮膚密切相關(guān)的一種重要的環(huán)境因素，根據(jù)波長不同，紫外線可分為長波紫外線（UVA，320-400nm）、中波紫外線（UVB，280-320nm）和短波紫外線（[JVC，200-280nm）。能夠到達(dá)地球表面的紫外線僅包括UNA和UVB，與UVA相比，同等劑量的UVB對(duì)皮膚的損傷強(qiáng)度是UVA的1000倍左右。
　　 成纖維細(xì)胞是真皮的主要組成細(xì)胞，經(jīng)紫外線照射后，皮膚成纖維細(xì)胞的生長、分化和功能等

2、方面會(huì)發(fā)生明顯的改變。本課題組在前期工作中通過雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定和免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，小劑量UVB照射會(huì)導(dǎo)致皮膚成纖維細(xì)胞特有的骨架蛋白波形蛋白（vimentin）含量增加。波形蛋白含有胱天蛋白酶-8和-3的酶切位點(diǎn)，在細(xì)胞凋亡過程中，當(dāng)細(xì)胞中的波形蛋白被這類蛋白酶破壞以后，其降解產(chǎn)物能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　 目的：
　　 在UVB引起的皮膚成纖維細(xì)胞凋亡過程中，影響波形蛋白的胱天蛋白酶-8和-3是否能夠被UVB激活，與

3、胱天蛋白酶-8相關(guān)的受體相互作用蛋白-1如何變化；成纖維細(xì)胞特有的細(xì)胞骨架波形蛋白是否被胱天蛋白酶破壞，并橫向比較了另外兩種普遍存在的細(xì)胞骨架蛋白即微管蛋白和肌動(dòng)蛋白在凋亡過程中的變化，從而探討UVB對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　 方法：
　　 （1）體外培養(yǎng)人原代皮膚成纖維細(xì)胞并進(jìn)行傳代，用第3-6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；
　　 （2）為了選擇合適的UVB照射劑量和觀測(cè)時(shí)間，先用噻唑藍(lán)（MTT）比色法比較了不同劑量

4、UVB對(duì)成纖維細(xì)胞活力的影響，然后對(duì)比了150mJ/c㎡ UVB照射細(xì)胞后，在12h、24h、36h和48h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力的變化；
　　 （3）用Hoechst染色法對(duì)細(xì)胞核染色，比較150mJ/c㎡ UVB照射成纖維細(xì)胞后，在上述時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化并計(jì)算凋亡細(xì)胞的數(shù)量；
　　 （4）用熒光比色法檢測(cè)照射了150mJ/c㎡ UVB的成纖維細(xì)胞中，不同時(shí)間點(diǎn)的胱天蛋白酶-8和-3的活性變化；
　　 （5

5、）用細(xì)胞熒光和Western Blot技術(shù)檢測(cè)照射UVB誘導(dǎo)凋亡的成纖維細(xì)胞中波形蛋白的蛋白含量的變化；
　　 （6）用Western Blot技術(shù)檢測(cè)照射了150mJ/c㎡ UVB的成纖維細(xì)胞中，α-微管蛋白、β-微管蛋白和β-肌動(dòng)蛋白的蛋白含量的變化；
　　 （7）用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)照射了150mJ/c㎡ UVB的成纖維細(xì)胞中受體相互作用蛋白-1的mRNA和蛋白含量的變化。
　　

6、 結(jié)果：
　　 （1）50-300mJ/c㎡ UVB照射后24小時(shí)，皮膚成纖維細(xì)胞的活力出現(xiàn)不同程度的下降；150mJ/c㎡UVB照射細(xì)胞以后，在12h、24h、36h和48h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞活力逐漸降低；
　　 （2）150mJ/c㎡UVB能夠誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，當(dāng)胱天蛋白酶的活性被抑制時(shí)，UVB誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞數(shù)量減少：
　　 （3）150mJ/c㎡UVB照射后，成纖維細(xì)胞的胱天蛋白酶-8和-3被激活，

7、在照射后12h時(shí)，兩者活性明顯升高，隨著時(shí)間的延長，其活性逐漸降低，在照射后48h時(shí)，其活性最低；
　　 （4）當(dāng)抑制了胱天蛋白酶-8的激活時(shí)，胱天蛋白酶-3的活化延遲；反之，當(dāng)胱天蛋白酶-3的活性被抑制時(shí)，胱天蛋白酶-8的活化也出現(xiàn)延遲；
　　 （5）當(dāng)分別抑制胱天蛋白酶-8和-3的活性時(shí)，凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯減少；
　　 （6）在UVB誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞凋亡過程中，波形蛋白的含量增加，β-微管蛋白的含量減少，α

8、-微管蛋白和β-肌動(dòng)蛋白的含量不變；
　　 （7）在凋亡的成纖維細(xì)胞中，受體相互作用蛋白-1的mRNA含量減少，其蛋白含量升高。
　　 結(jié)論：
　　 （1）在UVB誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞凋亡過程中，活化的胱天蛋白酶-8和-3互相影響，共同發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用；
　　 （2）當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)，活化的胱天蛋白酶-8和-3不能通過水解其底物波形蛋白而影響細(xì)胞的凋亡；
　　 （3）在細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞中減少的