GCK促進紫外線照射細胞凋亡的初步研究.pdf

1、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)是一組可被多種信號激活的絲/蘇氨酸蛋白激酶。經(jīng)磷酸化活化的絲裂原活化蛋白激酶，可參與多種細胞生命活動，如調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，誘導細胞凋亡、調(diào)節(jié)細胞周期等。MAPK誘導細胞凋亡的作用，尤其是誘導腫瘤細胞凋亡的作用，已成為人們關注的焦點?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)p38，ERK5，ERK以及JNK4個亞族。其中ERK，JNK，p38MAPK三條通路與腫瘤細胞凋亡關系密切。<

2、br>　　 JNK信號通路是MAPK中重要的通路之一。最近的研究表明，JNK通路的激活與促凋亡作用有關?；罨腏NK通過磷酸化c-Jun和ATF2激活轉(zhuǎn)錄因子AP1，結果導致FasL表達增強，促進細胞凋亡。JNK介導細胞凋亡的另一途徑是通過磷酸化Bcl-2和Bcl-xL，而后促進線粒體釋放細胞色素c，從而激活Caspase級聯(lián)反應，導致細胞凋亡。
　　 GCK分子屬于Ser/Thr蛋白激酶，有研究表明GCK分子參與了JNK信號

3、通路，且表達外源性的GCK分子可以在細胞內(nèi)活化JNK。而通過RNAi技術沉默gck基因可以阻斷LPS和UV刺激活化JNK的信號通路。但是GCK分子具體如何調(diào)控JNK信號通路尚待探討。因此本文通過克隆GCK基因和構建轉(zhuǎn)基因細胞，繼而初步觀察了紫外線照射對促進UV誘導細胞凋亡的作用機制。論文共分為兩部分。
　　 1、人GCK基因克隆及其轉(zhuǎn)基因細胞的構建
　　 目的：克隆人GCK基因，并構建含有該目的基因的plRES2-EGF

4、P-GCK重組質(zhì)粒載體，并獲得穩(wěn)定表達GCK分子的GCK-HEK293轉(zhuǎn)基因細胞。
　　 方法：以pCMV5-GCK質(zhì)粒為模板，PCR法獲得gck基因，將其裝入plRES2-EGFP質(zhì)粒載體中，脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，用G418篩選出能穩(wěn)定表達GCK蛋白的GCK-HEK293轉(zhuǎn)基因細胞株。
　　 結果：成功構建了pIRES2-EGFP-GCK質(zhì)粒載體，并建立了穩(wěn)定表達人GCK蛋白的GCK－HEK293轉(zhuǎn)基因細胞株

5、。
　　 結論：構建了含人GCK基因的重組plRES2-EGFP-GCK質(zhì)粒載體和穩(wěn)定表達人GCK蛋白的GCK-HEK293轉(zhuǎn)基因細胞株，為該基因功能的后續(xù)研究奠定基礎。
　　 2、GCK分子對促進UV誘導HEK293細胞凋亡的研究
　　 目的：研究GCK分子促進UV誘導HEK293細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導機制。
　　 方法：分別選取GCK-HEK293轉(zhuǎn)基因細胞、plRES2-HEK293轉(zhuǎn)基因細胞、HEK2

6、93細胞2×105個細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)12h后，進行不同時間的UV照射。2min、4min、5min、6min。繼續(xù)培養(yǎng)24h。離心收集細胞，PI染色lmin，利用流式細胞術檢測細胞的死亡率。UV照射HEK293，5min，24h后，裂解細胞，收集上清檢測GCK分子的表達。
　　 結果：1．經(jīng)過不同時間UV的照射，在24h后，GCK-HEK293轉(zhuǎn)基因細胞與pIRES2-HEK29轉(zhuǎn)基因細胞和HEK293相比，細胞的死亡率