中波紫外線誘導(dǎo)人表皮Langerhans細(xì)胞凋亡及EGCG抗凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、背景和目的在25年前就發(fā)現(xiàn)紫外線可以影響免疫系統(tǒng)。光生物學(xué)領(lǐng)域大量研究證實(shí)了紫外線可介導(dǎo)免疫抑制甚至可誘發(fā)皮膚癌前期病變及皮膚癌。日光輻射的免疫抑制作用主要是由其中的中波紫外線(UVB)介導(dǎo)，雖然最近也有一些實(shí)驗(yàn)證實(shí)長波紫外線也可以影響免疫系統(tǒng)，但這方面的證據(jù)少而不全面。 Langerhans細(xì)胞為樹突狀細(xì)胞(DC)系統(tǒng)中一種獨(dú)特類型，它是皮膚中主要的抗原遞呈細(xì)胞，在免疫系統(tǒng)中起著重要作用。因此也是紫外線所致免疫抑制的主要靶細(xì)胞

2、。UVB輻射后，紫外線暴露部位LC減少并與紫外線的輻射有劑量依賴性，而引流淋巴結(jié)獲得的LC有紫外線介導(dǎo)的DNA損傷。這些都證實(shí)了紫外線對LC的損傷作用。由于表皮中LC僅占細(xì)胞總數(shù)的2﹪～5﹪，其分離純化比較困難，但其表面的CD1a為人表皮LC特異性標(biāo)記分子，可用來鑒定及分選表皮LC，故本實(shí)驗(yàn)擬采用聯(lián)合密度梯度離心與免疫磁珠的方法以獲得較高純度及優(yōu)良活性的LC。 凋亡是機(jī)體主動(dòng)地、高度有序的清除無用細(xì)胞(包括損傷、衰老和突變細(xì)胞)

3、的過程，它是機(jī)體維持自身穩(wěn)定的基本生理機(jī)制。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期密切相關(guān)。細(xì)胞周期(cellcycle)是連續(xù)分裂的細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷的整個(gè)過程。阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程可引起凋亡；而凋亡也常伴隨有生長阻滯。 p53蛋白是人體中重要的“基因組衛(wèi)士”。它可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、監(jiān)視腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在正常細(xì)胞中，p53蛋白主要位于胞漿中，并與JUK或MDM2結(jié)合。UVB損傷細(xì)胞后，p53蛋白經(jīng)磷酸化修飾后，脫

4、離了MDM2及JUK，穩(wěn)定性及活性均提高，半衰期延長，累積量增加。進(jìn)入核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控一系列下游靶基因的表達(dá)?？墒辜?xì)胞從增殖狀態(tài)進(jìn)入周期阻滯，等待DNA修復(fù)；若DNA不能及時(shí)修復(fù)，則通過促使Bax和Bcl-2結(jié)合而促進(jìn)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c外泄而激活細(xì)胞凋亡通路。為了探討UVB所致的皮膚LC減少是否與UVB對LC光損傷有關(guān)以及表沒食子兒茶素沒食子酸脂(EGCG)可否保護(hù)LC免受UVB損傷，首先我們用UVB輻射分離純化后獲得的LC，觀

5、察其凋亡率變化，同時(shí)觀察加入EGCG后凋亡率的變化。為了進(jìn)一步探討EGCG可有效抗凋亡的機(jī)制。我們選擇了細(xì)胞周期，以及細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路上重要的信號調(diào)節(jié)蛋白p53作為研究對象，對EGCG抗凋亡機(jī)制作進(jìn)一步的探討。 綠茶提取物茶多酚(Greenteapolyphenols，GTP)的主要活性成份表沒食子兒茶素沒食子酸脂(epigallocatechingallate，EGCG)等有著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，如吸收紫外線、抗炎、清除氧自

6、由基、抗過氧化、抗凋亡及抗腫瘤等作用。本課題小組已對中波紫外線照射原代角質(zhì)形成細(xì)胞及其細(xì)胞株和成纖維細(xì)胞等所造成的光損傷與EGCG的光保護(hù)作用進(jìn)行了系列研究。但對LC的研究目前國內(nèi)外都較少。本項(xiàng)目旨在研究EGCG對分離純化的人LC所具有的光保護(hù)作用及作用機(jī)理。 方法1.分離純化人表皮LC：將正常成人包皮消化后得到表皮細(xì)胞混懸液，聯(lián)合采用密度梯度離心和免疫磁珠法分離純化人表皮LC，將分選后的細(xì)胞用結(jié)合有FITC的鼠抗人CD1a單抗

7、標(biāo)記，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測LC的純化率，采用0.4﹪臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性。 2.UVB誘導(dǎo)LC凋亡及EGCG抗凋亡作用研究：用上述方法分離純化后的LC分為非照光對照組、照光組和EGCG處理組。非照光對照組不接受30mJ/cm2UVB輻射，照光組接受30mJ/cm2UVB輻射，EGCG處理組的處理：接受30mJ/cm2UVB輻射后，加入200μg/mlEGCG，37℃,5﹪CO2培養(yǎng)4小時(shí)后PI染色測定細(xì)胞凋亡率，并做統(tǒng)計(jì)分析。

8、 3.中波紫外線輻射后LC及EGCG處理輻射后LC的細(xì)胞周期分析：分離及分組處理方法同前。37℃，5﹪CO2培養(yǎng)4小時(shí)后PI染色測定細(xì)胞周期，分析各期細(xì)胞相對比例，并做統(tǒng)計(jì)分析。 4.UVB輻射LC后p53蛋白水平變化的研究：分離及分組處理方法同前。37℃,5﹪CO2培養(yǎng)4小時(shí)后提取總蛋白，WesternBlotting法測定p53蛋白含量，觀察條帶，凝膠成像系統(tǒng)掃描處理。 5.UVB輻射LC后磷酸化p53蛋白水平變

9、化的研究：分離及分組處理方法同前。37℃，5﹪CO2培養(yǎng)4小時(shí)后提取總蛋白，WesternBlotting法測定磷酸化p53蛋白含量，觀察條帶，凝膠成像系統(tǒng)掃描處理。并與p53蛋白比較其變化差異。 6.UVB輻射LC后Bcl-2蛋白水平變化的研究：分離及分組處理方法同前。37℃,5﹪CO2培養(yǎng)4小時(shí)后提取總蛋白，WesternBlotting法測定Bcl-2蛋白含量，觀察條帶，凝膠成像系統(tǒng)掃描處理。 結(jié)果1.聯(lián)合采用密度

10、梯度離心和免疫磁珠的方法分離純化人表皮LC后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測LC的純化率為84.48﹪±7.96﹪，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞活性為96.9﹪±0.7﹪。 2.空白對照組無明顯凋亡峰，細(xì)胞凋亡率為1.995﹪±0.070﹪，接受30mJ/cm2UVB輻射組凋亡率為7.450﹪±0.113﹪，EGCG處理組凋亡率為3.565﹪±1.336﹪，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。提示接受30mJ/cm2UVB輻射后細(xì)胞凋亡率高

11、于對照組和EGCG處理組。 3.與未輻射UVB對照組相比，接受30mJ/cm2UVB輻射LCS期細(xì)胞數(shù)明顯增加，幾乎沒有G2/M期細(xì)胞。而EGCG處理組S期細(xì)胞數(shù)明顯減少，G2/M期細(xì)胞數(shù)略有增加。 4.接受不同劑量(0、30、60、90mJ/cm2)UVB照射后4h各組細(xì)胞及加入EGCG細(xì)胞的p53蛋白光密度值與GAPDH光密度比值依次為1.073±0.077，1.022±0.021，1.041±0.021，1.060

12、±0.019，1.055±0.068各組與0mJ/cm2組相比，差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05) 5.接受不同劑量(0、30、60、90mJ/cm2)UVB照射后4h各組細(xì)胞及加入EGCG細(xì)胞的ser15磷酸化p53光密度值與GAPDH光密度比值依次為0±0，0.789±0.019，0.907±0.010，0.956±0.017，0.487±0.032各組與0mJ/cm2組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)不同劑量(0

13、、30、60、90mJ/cm2)UVB照射4小時(shí)后，磷酸化p53蛋白表達(dá)隨劑量增加而分別上升14.90﹪和5.44﹪。加入EGCG后磷酸化p53蛋白有所下降，但仍不能恢復(fù)至正常。 6.接受不同劑量(0、30、60、90mJ/cm2)UVB照射后4h各組細(xì)胞Bcl-2蛋白光密度值與GAPDH光密度比值依次為0.835±0.052，0.686±0.033，0.562±0.025，0.389±0.088，0.726±0.043各組與0

14、mJ/cm2組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)不同劑量(0、30、60、90mJ/cm2)UVB照射4小時(shí)后，Bcl-2蛋白表達(dá)隨劑量增加而分別下降17.84﹪，32.69﹪和53.41﹪。加入EGCG后Bcl-2蛋白下降程度有所減輕，但不能恢復(fù)至正常。 結(jié)論紫外線可顯著誘導(dǎo)分離純化的人表皮LC凋亡，這可能是機(jī)體抵抗紫外線損傷，主動(dòng)清除損傷或突變細(xì)胞的表現(xiàn)之一。對UVB輻射后的LC加入EGCG凋亡率有所下降3.5650﹪

15、±1.3364﹪，表明EGCG有良好的抗凋亡作用。但EGCG的抗凋亡作用是有限的。 對細(xì)胞周期進(jìn)行分析：經(jīng)30mJ/cm2UVB輻射后，LCS期增多，細(xì)胞群被阻滯在S期，推測中波紫外線抑制了細(xì)胞DNA合成，將增殖態(tài)細(xì)胞阻滯于S期，進(jìn)而誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。UVB輻射后細(xì)胞加入EGCG，G0/G1期細(xì)胞及G2/M期細(xì)胞均有增加而S期細(xì)胞顯著減少，細(xì)胞順利通過S期，推測與EGCG促進(jìn)DNA修復(fù)合成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖有關(guān)。同時(shí)G0/G1期細(xì)

16、胞及G2/M期細(xì)胞的增加可能為S期細(xì)胞減少而相對性增加所致。 對凋亡下游信號傳導(dǎo)通路研究：在未應(yīng)激的狀態(tài)下，LC中p53蛋白主要以非磷酸化的無活性形式存在。UVB輻射后，磷酸化p53蛋白水平明顯升高，提示其為UVB輻射細(xì)胞后細(xì)胞調(diào)控信號通路上的重要因子。推測UVB輻射后LC的凋亡率增加及S期阻滯，可能是通過活化細(xì)胞內(nèi)p53蛋白發(fā)生ser15磷酸化而發(fā)揮下游作用。Bcl-2蛋白為磷酸化p53蛋白激活細(xì)胞凋亡通路上的下游蛋白。它主要