穩(wěn)定高表達對核苷（酸）類似物耐藥HBV毒株肝癌細胞系的建立.pdf

1、核苷（酸）類似物治療能快速有效地抑制HBV復制，延緩肝臟病變的進展，從而降低肝硬化和肝癌的發(fā)生率。但長期抗病毒治療容易出現(xiàn)對核苷（酸）類似物耐藥，導致治療失敗。對耐藥機制的體外研究以及篩選新的針對耐藥HBV毒株的抗病毒藥物需要合適的體外研究模型。為建立穩(wěn)定高表達耐核苷（酸）類似物HBV變異株肝癌細胞系，我們開展了以下工作:
　　在研究的第一部分中，我們構建了8種HBV表達質粒，包括野生型質粒以及常見的7種耐不同核苷（酸）類似物的變

2、異型質粒，以用于人肝癌細胞HepG2和Huh7細胞系的轉染研究和篩選穩(wěn)定細胞系。選用野生型質粒進行細胞轉染、潮霉素篩選、陽性克隆篩選、長期傳代以及有限稀釋純化細胞克隆等步驟，篩選出一株表達野生型HBV穩(wěn)定細胞株，建立及完善了篩選穩(wěn)定細胞系的體系，以應用于后續(xù)耐藥HBV穩(wěn)定細胞系的篩選。
　　在研究的第二部分中，我們應用第一部分工作中建立的篩選體系，經過大規(guī)模的篩選獲得了一株高表達耐拉米夫定HBV穩(wěn)定細胞株，并命名為HepG2-HS

3、204V。采用Southern blot技術證實該細胞株胞內HBV復制水平顯著高于HepG2.2.15細胞株，上清液中HBsAg和HBeAg病毒蛋白水平顯著高于HepG2.2.15，達10倍以上。胞外分泌的病毒顆粒水平與HepG2.2.15相似。該細胞株顯示出預期的耐藥表型特征，包括對拉米夫定耐藥以及對阿德福韋敏感。采用Southern blot方法證實該細胞株內HBV基因序列以整合的形式存在;Northernblot的方法證實2.4/

4、2.1 kb的亞基因組RNA的轉錄水平明顯高于HepG2.2.15，提示可能該細胞株產生高水平HBsAg的原因。最后我們用CsCl梯度離心分離細胞上清各組份，采用免疫電鏡以及免疫印跡的方法證實該細胞株可以分泌完整的病毒顆粒以及不同形式的亞病毒顆粒。經過長期傳代證明了其穩(wěn)定的生物學特性。在研究的第三部分中，我們同樣應用建立的篩選體系，篩選出一株高表達耐阿德福韋N236T變異HBV穩(wěn)定細胞株，命名為HepG2-HS236T。同時篩選出一株表

5、達耐阿德福韋A181V變異HBV穩(wěn)定細胞株。采用Southern blot技術證實該細胞株胞內HBV復制水平顯著高于HepG2.2.15細胞株，上清液中HBsAg和HBeAg病毒蛋白水平顯著高于HepG2.2.15，達5倍以上。胞外分泌的病毒顆粒水平與HepG2.2.15相似。表型實驗顯示了預期的表型耐藥特征，即對拉米夫定敏感以及對阿德福韋的敏感性明顯降低。HepG2-HS236T細胞株中同樣發(fā)現(xiàn)了以整合形式存在的HBV序列，采用常規(guī)電

6、鏡也發(fā)現(xiàn)了存在于細胞上清液中的病毒顆粒。長期傳代證實了其穩(wěn)定的生物學特性。而表達耐阿德福韋A181V變異HBV穩(wěn)定細胞株其病毒蛋白水平為HepG2.2.15 2-3倍左右，但胞內HBV復制水平以及胞外HBV DNA分泌水平較低。
　　在研究的第四部分中，我們同樣應用建立的篩選體系，篩選出一株耐恩替卡韋L180M+M204V+T184S變異型和一株L180M+M204V+M250L變異型HBV細胞株。但其胞內HBV復制以及胞外HBV