昆蟲新細(xì)胞系的建立及高表達(dá)克隆株的篩選.pdf

1、E s t a b l i s h m e n t o f A N e w I n s e c t C e l lL i n ea n d N o v e l C e l lC l o n e sr n ‘‘ ‘ ‘ 。上h e s i ss u b m i t t e d t oQ z n g d a o A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t yI nF u l f i l l m e n

2、 t o f t h eR e q u i r e m e n tf o r t h eD e g r e eo f —M a s t e r o f A g r o n o m y 1 一 一S h a n M i n g( D e p a r t m e n t o f A g r o n o m y a n d P l a n tP r o t e c t i o n )S u p e r v i s o r ：L iG u o

3、x u nQ i n g d a o ．C h i n aJ u n e ，2 0 1 3青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 中文摘要昆蟲新細(xì)胞系的建立及高表達(dá)克隆株的篩選摘要眾所周知，實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用的T n 5 8 1 - 4 ( 商品名H i g hF i V e ) 是一株病毒敏感性高、重組蛋白表達(dá)水平高的細(xì)胞系，但其生物特性不穩(wěn)定，長(zhǎng)期的傳代培養(yǎng)會(huì)引起生長(zhǎng)特性的改變。最近在T n 5 8 1 - 4 細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了一種名為T N C L

4、 的諾達(dá)病毒。本研究建立了一株新的粉紋夜蛾細(xì)胞系，并對(duì)已有的Q B —T n 9 —4 S 細(xì)胞系進(jìn)行單細(xì)胞克隆，以獲得優(yōu)良的無(wú)毒細(xì)胞株，主要結(jié)果如下：1 ．以S F 9 和T n 5 8 1 - 4 細(xì)胞分別為陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)親本Q B - T n 9 - 4 s進(jìn)行T N C L 檢測(cè)。對(duì)A c M N P V C 侵染和未侵染的細(xì)胞系進(jìn)行R T - P C R 分析，最后只有T n 5 8 1 - 4 得到目的擴(kuò)增產(chǎn)物，證明

5、Q B - T n 9 - 4 s 不攜帶T N C L 病毒。對(duì)Q B —T n 9 —4 s進(jìn)行單細(xì)胞克隆，篩選得到兩個(gè)克隆株，分別命名為Q B —C L —A 和Q B —C L —B 。2 ．Q B - T n 9 - 4 s 及其克隆株都是懸浮細(xì)胞系。Q B - C L - A 和Q B —c L —B 都由比親代Q B - T n 9 - 4 s ( 1 8 ．2 ×5 7 ．7 um ) 稍小的梭形細(xì)胞組成，大小

6、約為1 8 ．4 ×4 9 ．4u m ，比T n 5 8 1 - 4 ( 1 6 ．6x3 8 ．4u m ) 稍大。3 ．測(cè)定了克隆株的生長(zhǎng)速率和群體倍增時(shí)間。其中Q B - C L - B 生長(zhǎng)速率比親代Q B —C L —A 、Q B —T n 9 —4 s 和T n 5 8 1 - 4 稍快，在第5 天細(xì)胞密度達(dá)最大值1 ．6 5x10 6 C e l l S ／m L ，Q B - C L - B 、Q B - C

7、 L —A 、Q B —T n 9 —4 s 和T n 5 8 1 —4 的群體倍增時(shí)間分別為20 ．2 、2 1 ．7 、20 ．9 和2 2 ．7 h 。4 ．病毒侵染試驗(yàn)表明，Q B —C L —A 、Q B —C L —B 、Q B —T n 9 - 4 s 與T n 5 8 1 —4 對(duì)野生型A c M N P V 的敏感性相近，感染率均達(dá)到9 3 ％。克隆株Q B - C L - B 的出芽性病毒產(chǎn)量( 3 ．7 6 

8、15;1 07 T C I D ，。／m L ) 高于親代Q B - T n 9 - 4 s ( 3 ．3 7 ×l 07 T C I D ，。／m L ) 和T n 5 8 1 —4( 2 ．98 ×1 07 T C I D ，。／m L ) 。Q B - C L - A 與Q B - C L —B 的多角體產(chǎn)量分別為兒1 ．7 和1 0 2O B s ／c e l l 。5 ．重組蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果表明，克隆株

9、Q B - C L - B 重組蛋白表達(dá)水平比Q B - T n 9 - 4 S 、Q B - C L - A 和r n 5 B l - 4 稍高。Q B —C L —B 的分泌性堿性磷酸酶( s e c r e t e da l k a li n e p h o s p h a t a s e ，S E A P ) 產(chǎn)量分別為Q B —T n 9 —4 s 、Q B —e L —A 和T n 5 8 1 —4 的3 ．3 、2 ．1