新型核苷類似物dT-QX抗肝癌細(xì)胞活性及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、近年來，肝癌因其高發(fā)病率、高死亡率而已成為我國(guó)重大疾病之一，因此研發(fā)安全有效的抗肝癌藥物既有重要的醫(yī)學(xué)意義，也有緊迫的市場(chǎng)需求。以索拉非尼為例，肝癌分子靶向治療已成為抗肝癌藥物研發(fā)的新方向和熱點(diǎn)。索拉非尼是一種多酪氨酸激酶抑制劑，它是目前唯一被批準(zhǔn)用于治療晚期肝癌的口服藥物，其效果仍然有限只能暫時(shí)延緩肝癌發(fā)展。和酪氨酸激酶一樣，在癌細(xì)胞中普遍高表達(dá)的胸苷激酶（TKs）是一種潛在的抗癌分子靶標(biāo)。已有針對(duì)TKs設(shè)計(jì)的化療藥物例如阿昔洛韋、齊

2、多夫定（AZT）等雖具有抗病毒活性，但在臨床上對(duì)癌癥治療并無療效。最新研究表明，上調(diào)肝癌患者的TKs并用核苷類似物的聯(lián)合治療方案同樣收效甚微。這可能是齊多夫定等核苷類似物整合入DNA后很容易經(jīng)DNA修復(fù)過程被清除掉。有鑒于此，在齊多夫定分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并合成了一種具有選擇性抗癌效果的新型核苷類似物dT-QX，該類似物具有脫氧胸苷（dT）與喹喔啉基團(tuán)（QX）共價(jià)結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)，其中的脫氧胸苷基團(tuán)能夠被TKs識(shí)別，而喹喔啉基團(tuán)則是一種已

3、知的DNA插入劑。本課題對(duì)dT-QX抗癌活性及其殺細(xì)胞機(jī)理進(jìn)行研究，以期為核苷類化合物發(fā)展為更有效的抗腫瘤化療藥物積累必要的學(xué)術(shù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時(shí)依據(jù)胸苷代謝和補(bǔ)救途徑的相關(guān)酶是其抗癌分子靶標(biāo)，揭示其選擇性活性機(jī)制并在此基礎(chǔ)上尋求增加肝癌細(xì)胞對(duì)dT-QX敏感性的方法，旨在為針對(duì)臨床肝癌治療中存在的復(fù)雜多樣性提供合理可行的解決方案。
　　本課題主要研究工作總結(jié)如下：
　　（1）研究了dT-QX的抗癌活性。
　　結(jié)果：體外細(xì)

4、胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)dT-QX能殺死多種癌細(xì)胞，包括人肝癌細(xì)胞Hep3B和HepG2、小鼠肝癌H22細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7以及大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6，尤其對(duì)帶有乙肝病毒的肝癌細(xì)胞Hep3B毒性最強(qiáng)并且對(duì)人正常肝細(xì)胞HL-7702幾乎無毒，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明dT-QX在小鼠皮下H22肝癌腫瘤模型中瘤內(nèi)注射低劑量的dT-QX（相當(dāng)于每只小鼠注射劑量為0.13毫克/千克/次，共兩次）能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)?？疾靸煞N對(duì)照化合物AZT和Pip-QX后，發(fā)現(xiàn)

5、AZT幾乎無細(xì)胞毒性，而具有QX基團(tuán)的化合物Pip-QX對(duì)癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞均表現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，AZT與Pip-QX聯(lián)用結(jié)果與Pip-QX毒性相同。與臨床用抗癌藥物阿霉素比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿霉素對(duì)HL-7702毒性非常大，但dT-QX對(duì)其幾乎無毒。
　　結(jié)論：dT-QX具有選擇性抗肝癌活性，而且較于阿霉素對(duì)于人正常肝細(xì)胞更安全。dT-QX的選擇性抗癌活性是通過dT和QX兩個(gè)功能基團(tuán)獨(dú)特的共價(jià)結(jié)合結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)的，dT基團(tuán)靶向癌細(xì)胞，QX

6、則誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。
　　（2）初步探索了dT-QX在肝癌細(xì)胞中如何誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
　　結(jié)果：經(jīng)Alexa Fluor488?鬼筆環(huán)肽分析細(xì)胞完整性觀察到dT-QX能破壞Hep3B細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但對(duì)人正常肝細(xì)胞HL-7702的結(jié)構(gòu)和形態(tài)沒有影響。BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)dT-QX能抑制肝癌細(xì)胞HepG2和Hep3B的DNA合成，且效果對(duì)于Hep3B更明顯，但其對(duì)HL-7702幾乎無影響，這與以上細(xì)胞活性MTT檢測(cè)結(jié)果一致，dT-Q

7、X對(duì)Hep3B的作用比HepG2更強(qiáng)，可能由于Hep3B是乙肝病毒感染細(xì)胞株的緣故；考察對(duì)照化合物發(fā)現(xiàn)AZT并不能抑制細(xì)胞DNA合成，Pip-QX則能顯著抑制細(xì)胞DNA合成。線粒體超氧化物熒光學(xué)分析顯示在Hep3B細(xì)胞DNA合成被抑制后，dT-QX會(huì)使Hep3B細(xì)胞線粒體產(chǎn)生大量超氧化物，其對(duì)HL-7702細(xì)胞幾乎無影響。
　　結(jié)論：dT-QX能選擇性抑制肝癌細(xì)胞核內(nèi)DNA合成，并且這種作用是由其分子結(jié)構(gòu)上的QX基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)的。dT

8、-QX是通過抑制肝癌細(xì)胞DNA的合成誘導(dǎo)其發(fā)生線粒體超氧化物應(yīng)激引起細(xì)胞線粒體功能障礙從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
　?。?）闡明了dT-QX的選擇性活性機(jī)理并確定了增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)dT-QX敏感性的方法。
　　結(jié)果：采用細(xì)胞器熒光染料以及細(xì)胞器熒光共定位分析試劑檢測(cè)到細(xì)胞攝入dT-QX后dT-QX是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中具有TK1），顯示dT-QX可能是通過TK1磷酸化活化的。改變細(xì)胞胸苷濃度分析dT-QX活性發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胸苷濃度增加，

9、不會(huì)影響dT-QX活性（10μM以上濃度），但會(huì)導(dǎo)致dT-QX對(duì)Hep3B的半數(shù)效應(yīng)濃度EC50變大；細(xì)胞胸苷濃度減少，對(duì)dT-QX在Hep3B細(xì)胞上的半數(shù)效應(yīng)濃度EC50無影響，但細(xì)胞毒性有明顯加和作用。分析dT-QX選擇性活性與細(xì)胞TK1和TYMP表達(dá)水平之間的關(guān)聯(lián)性表明dT-QX在四種具有TK1高表達(dá)的肝癌細(xì)胞Hep3B、HepG2、Bel-7402、Bel-7404中表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，而對(duì)于TK1含量很低的人正常肝細(xì)胞HL-

10、7702幾乎無毒；并且dT-QX在TK1高表達(dá)，TYMP幾乎不表達(dá)的Hep3B細(xì)胞上毒性最強(qiáng)，在TK1表達(dá)量最低的人正常肝細(xì)胞HL-7702上毒性最弱，在TK1高表達(dá)但TYMP同樣高表達(dá)的Bel-7402細(xì)胞上毒性較其它肝癌細(xì)胞要低。進(jìn)一步通過調(diào)控細(xì)胞中TK1或TYMP蛋白水平分析dT-QX活性發(fā)現(xiàn)，經(jīng)siRNA干擾，在Hep3B中下調(diào)TK1可明顯降低dT-QX活性，下調(diào)TYMP不影響其活性，因?yàn)镠ep3B幾乎不表達(dá)TYMP，siRNA

11、干擾對(duì)Hep3B的TYMP表達(dá)量無影響；對(duì)于Bel-7402，下調(diào)TK1也降低了dT-QX活性，下調(diào)TYMP則使其活性明顯提高。在Hep3B和Bel-7402細(xì)胞上用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)TK1，結(jié)果顯示整合TK1基因的陽性質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒都能使兩種細(xì)胞過表達(dá)TK1，這可能是由于陰性對(duì)照質(zhì)粒的載體上具有CMV強(qiáng)啟動(dòng)子能啟動(dòng)某些基因的非特異表達(dá)；而且在兩種細(xì)胞中過表達(dá)TK1都能提高dT-QX的活性。最后采用能穩(wěn)定表達(dá)且表達(dá)特異性強(qiáng)的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方

12、法上調(diào)細(xì)胞TK1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TK1基因重組慢病毒顆粒能上調(diào)細(xì)胞TK1并且不會(huì)影響TYMP的表達(dá)情況，而陰性對(duì)照慢病毒顆粒也不會(huì)影響目的蛋白表達(dá)量；與之前過表達(dá)TK1結(jié)果一致，上調(diào)TK1使dT-QX抗Hep3B和Bel-7402細(xì)胞活性明顯提高。
　　結(jié)論：dT-QX是TKs的底物，它在細(xì)胞中由TKs磷酸化后活化。dT-QX的選擇性活性與細(xì)胞的TK1和TYMP表達(dá)量有關(guān)，TK1低表達(dá)會(huì)降低dT-QX活性。在肝癌細(xì)胞中上調(diào)TK1能增加肝