應(yīng)用RNA干涉技術(shù)抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性的初步研究.pdf

1、目的：建立以RNAi方法抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶表達(dá)的技術(shù)平臺，在大鼠心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞中檢驗(yàn)抑制效果，為后續(xù)以RNAi的策略治療多種心臟疾病和心腦血管疾病奠定基礎(chǔ)。 方法：以U6 RNA表達(dá)盒--細(xì)胞內(nèi)退火的策略構(gòu)建針對大鼠鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶mRNA第1053位～1071位核苷酸的siRNA；采用差速貼壁法體外原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞；NPY刺激培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染針對鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的siRNA，Western blot方法測定心

2、肌細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶表達(dá)水平，定磷法測定心肌細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的催化活性，<'3>H-leu摻入量測定法觀察心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率的變化；采用組織貼塊法體外原代培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；梯度濃度的NPY刺激原代培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)，定磷法測定血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的催化活性，MTT法測定血管平滑肌細(xì)胞增殖速率的變化；特定濃度的NPY刺激血管平滑肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染針對鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的siRNA，Western blot方法測定血

3、管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶表達(dá)水平，MTT法測定血管平滑肌細(xì)胞增殖速率的變化，免疫組織化學(xué)染色測定血管平滑肌細(xì)胞中原癌基因c-fos表達(dá)水平的變化。 結(jié)果：完成大鼠心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞體外原代培養(yǎng)；成功構(gòu)建針對大鼠鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶mRNA第1053位～1071位核苷酸的siRNA；針對CaN的siRNA在原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中均可以有效地抑制NPY刺激引起的CaN表達(dá)上調(diào)；針對CaN的siRNA片段在原代培養(yǎng)的

4、心肌細(xì)胞中可以有效地抑制NPY刺激引起的CaN酶活性的上調(diào)，拮抗NPY對心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率的上調(diào)作用；濃度為10<'-6>mol/L的NPY適合作為刺激因素誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞中CaN活化；針對CaN的siRNA可以有效地抑制NPY引發(fā)的血管平滑肌細(xì)胞增殖，下調(diào)血管平滑肌細(xì)胞中原癌基因c-fos的表達(dá)。 結(jié)論：以U6 RNA表達(dá)盒——細(xì)胞內(nèi)退火的策略構(gòu)建的針對CaN β mRNA第1053位～1071位核苷酸的siRNA在原代