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文檔簡介
1、目的:建立以RNAi方法抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶表達(dá)的技術(shù)平臺,在大鼠心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞中檢驗(yàn)抑制效果,為后續(xù)以RNAi的策略治療多種心臟疾病和心腦血管疾病奠定基礎(chǔ)。 方法:以U6 RNA表達(dá)盒--細(xì)胞內(nèi)退火的策略構(gòu)建針對大鼠鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶mRNA第1053位~1071位核苷酸的siRNA;采用差速貼壁法體外原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞;NPY刺激培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染針對鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的siRNA,Western blot方法測定心
2、肌細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶表達(dá)水平,定磷法測定心肌細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的催化活性,<'3>H-leu摻入量測定法觀察心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率的變化;采用組織貼塊法體外原代培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞;梯度濃度的NPY刺激原代培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì),定磷法測定血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的催化活性,MTT法測定血管平滑肌細(xì)胞增殖速率的變化;特定濃度的NPY刺激血管平滑肌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染針對鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的siRNA,Western blot方法測定血
3、管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶表達(dá)水平,MTT法測定血管平滑肌細(xì)胞增殖速率的變化,免疫組織化學(xué)染色測定血管平滑肌細(xì)胞中原癌基因c-fos表達(dá)水平的變化。 結(jié)果:完成大鼠心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞體外原代培養(yǎng);成功構(gòu)建針對大鼠鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶mRNA第1053位~1071位核苷酸的siRNA;針對CaN的siRNA在原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中均可以有效地抑制NPY刺激引起的CaN表達(dá)上調(diào);針對CaN的siRNA片段在原代培養(yǎng)的
4、心肌細(xì)胞中可以有效地抑制NPY刺激引起的CaN酶活性的上調(diào),拮抗NPY對心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率的上調(diào)作用;濃度為10<'-6>mol/L的NPY適合作為刺激因素誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞中CaN活化;針對CaN的siRNA可以有效地抑制NPY引發(fā)的血管平滑肌細(xì)胞增殖,下調(diào)血管平滑肌細(xì)胞中原癌基因c-fos的表達(dá)。 結(jié)論:以U6 RNA表達(dá)盒——細(xì)胞內(nèi)退火的策略構(gòu)建的針對CaN β mRNA第1053位~1071位核苷酸的siRNA在原代
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