TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測慢性心房顫動患者心房肌中SK2通道m(xù)RNA的表達(dá).pdf

1、目的:心房顫動(Atrial Fibrillation，AF)簡稱房顫，是臨床常見的快速心律失常，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。隨著膜片鉗和分子生物學(xué)等技術(shù)在心血管疾病研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，人們在細(xì)胞和分子水平探索房顫發(fā)生和維持的機(jī)制，并為房顫的防治提供實驗依據(jù)已成為可能。近年，人類心房肌中出人意料的發(fā)現(xiàn)存在鈣激活鉀電流(IKca)，并確定該電流由SK2通道(Small conductance calcium-activated potassi

2、um channel 2，SK2)介導(dǎo)。使用SK2通道特異性阻斷劑蜂毒明肽(apamin)后，細(xì)胞動作電位復(fù)極期時程明顯延長，提示SK2通道在動作電位的復(fù)極期發(fā)揮作用。目前，有關(guān)房顫患者心房肌組織中SK2基因表達(dá)水平的檢測未見報道。本實驗采用TaqMan探針實時熒光定量PCR技術(shù)檢測13例風(fēng)濕性心臟病竇性心律患者和15例風(fēng)濕性心臟病慢性房顫患者心房肌組織中SK2通道α亞單位mRNA的表達(dá)水平，為探討SK2通道在房顫中的作用提供實驗依據(jù)。

3、方法:標(biāo)本來自瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體外循環(huán)手術(shù)患者常規(guī)切除的右心耳組織，患者經(jīng)心臟彩超和心電圖證實為風(fēng)心病竇性心律或風(fēng)心病慢性房顫。將標(biāo)本分為竇律組(SR組)和房顫組(AF組)，兩組間患者年齡無統(tǒng)計學(xué)差異。實驗操作步驟為:(1)心耳組織被迅速轉(zhuǎn)移至液氮中，備用。(2)提取心房肌組織總RNA。(3)總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成eDNA。(4)利用PCR技術(shù)將小部分eDNA擴(kuò)增，得到目的基因SK2和內(nèi)參基因β-actin的DNA片段。(5)將純化后DN

4、A片段與pMD18-TVector在16℃連接12h。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌中，涂布于固體LB培養(yǎng)板上，37℃孵育8h。(6)挑取平板上白色菌落，搖菌12h。提取質(zhì)粒，制做成標(biāo)準(zhǔn)品。(7)質(zhì)粒進(jìn)行TaqMan探針實時熒光定量PCR反應(yīng)，定量軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程式。(8)將(3)所得AF和SR兩組eDNA，進(jìn)行TaqMan探針實時熒光定量PCR。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式，計算出樣品初始模板量。(9)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)表示，使用t

5、檢驗檢測組間均數(shù)差異，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計在SPSS 13.0 for windows版軟件包上完成。結(jié)果:(1)利用紫外線線分光計對提取的總RNA進(jìn)行光吸收度測量，A260/280在1.90～2.10之間，A260/230在1.80～2.10之間，濃度大于300ng/μl，表明RNA的純度及濃度在理想范圍內(nèi)；總RNA電泳結(jié)果顯示:28S條帶和18S條帶清晰，無托尾；灰度比大于1，5S帶不明顯，表明RNA完整性較好。(

6、2)SK2和β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99。SK2的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.219X+6.44，R2=0.997；β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=0.242X+7.12，R2=0.997。(3)SR組和AF組SK2/β-actin比值分別為0.0782±0.0442(n=13)和0.0423±0.093(n=15)，t=2.753(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:(1)人體心房肌組織中存在