五種大鼠和小鼠重要病毒熒光定量PCR檢測方法的建立.pdf

1、大鼠和小鼠是生物醫(yī)學科研實驗中用途最廣和使用量最大的實驗動物，實驗動物的質量決定了科研結果的準確性和可靠性。目前，我國國家標準規(guī)定的SPF級實驗大鼠和小鼠必須或必要檢測的病毒項目是15種，除此之外，依然有不少病毒危害著實驗鼠的健康。本研究選取5種暫未列入我國SPF級實驗動物檢測標準的大鼠和小鼠病毒，分別為大鼠細小病毒（Rat parvovirus，RPV）、大鼠微小病毒(Rat minute virus，RMV)、鼠腦心肌炎病毒（Enc

2、ephalomyocarditis virus，EMV）、小鼠輪狀病毒(Murine Rotavirus，MRV)和大鼠疑似泰勒氏病毒(Theiler's-like virus of Rats，TLV)，以這些病原為研究對象，分別建立快速、準確的診斷方法，為實驗動物的健康監(jiān)護提供技術支撐。
　　1.RMV和RPV雙重TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立和應用
　　以實驗大鼠中常見的兩種細小病毒RMV和RPV為研究對象，根

3、據GenBank中已公布的RMV的NTU1株全基因組序列（GenBank登錄號:JX627317.1），在3389～3589 bp處設計引物和TaqMan探針。以及RPV的NTU1毒株全基因組序列(GenBank登錄號:JX827169)，在863-967 bp處設計引物和Taqman探針。以構建的質粒標準品為模板建立熒光定量PCR檢測方法，并對該鑒別檢測方法的靈敏度、穩(wěn)定性和特異性進行評價;用建立的熒光定量方法對50份臨床樣品進行檢測

4、，并用ELISA的商品試劑盒進行驗證，驗證該方法的可靠性。結果顯示，建立的RMV和RPV的雙重熒光定量PCR方法標準曲線的線性關系良好，R2值可達0.99，最低檢測限可以達到30拷貝/μL，使用建立的熒光定量PCR方法和血清學ELISA檢測試劑盒，同時對50只大鼠的肝臟樣本和血清樣品進行對應的檢測，檢測準確性為100％。因此，建立的RMV和RPV雙重TaqMan實時熒光定量PCR方法具有特異、靈敏的特點，適用于實驗大鼠臨床的監(jiān)測。

5、>　　2.EMV的TaqMan探針熒光定量RT-PCR檢測方法建立
　　根據EMV的PEC9毒株全基因組序列（GenBank登錄號:DQ288856.1），設計一對特異性引物和TaqMan探針，建立EMV的TaqMan探針熒光定量RT-PCR方法，通過條件優(yōu)化，對其特異性，敏感性，穩(wěn)定性進行分析，結果顯示，建立的熒光定量PCR標準曲線的線性關系良好，R2值可達0.99;敏感性最低檢測限達到1拷貝/μL，高于普通PCR方法1000倍

6、;其特異性強，常見的小鼠病毒株均無特異性擴增;重復性好，批內和批間變異系數均小于2％。利用該方法對上海市120份小鼠腦組織樣品進行檢測，未檢測到陽性感染鼠，本研究為EMV病毒感染的分子檢測、制定國家標準提供良好的方法。
　　3.MRV的TaqMan探針熒光定量RT-PCR檢測方法建立
　　根據MRV的EB-C8/G16P毒株VP1基因（Genbank登錄號:KJ477127.1），設計引物和Taqman探針，構建擴增曲線，制

7、作標準曲線，建立MRV熒光定量RT-PCR方法，并檢測其特異性、敏感性和穩(wěn)定性，從而初步建立檢測方法并應用于動物房小鼠的檢測。結果顯示:建立的MRV熒光定量RT-PCR方法標準曲線的線性關系良好，R2值可達0.99;最低檢測到10拷貝/μL，是常規(guī)PCR的100倍;與常見的小鼠病毒株均無特異性擴增;批內和批間變異系數均小于2％，表明該方法重復性好。所建立的MRV熒光定量RT-PCR方法具有特異、靈敏、準確的特點。對上海市120份小鼠腸道

8、樣品的檢測的結果，為MRV的流行病學調查、及國家/地方標準的制定提供了可靠的借鑒。
　　4.TLV的熒光定量RT-PCR檢測方法的建立
　　為了建立一種能在臨床上快速、準確地檢測TLV的方法，我們運用熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)的技術，特異性地針對TLV病毒核酸進行檢測。根據GenBank中TLV代表毒株NGS910的全基因組序列（GenBank登錄號:AB090161.1），通過基因合成序列作為質粒標準品的模板

9、，同時根據3622～3729 bp的特異性序列，設計引物和TaqMan性探針，優(yōu)化反應體系及條件，進行qRT-PCR擴增，從而建立起了TLV的TaqMan探針qRT-PCR方法，并對其靈敏度、穩(wěn)定性和特異性進行評價。結果顯示，建立的TLV的qRT-PCR檢測方法，標準曲線線性關系良好，R2值可達到0.99，靈敏度可達30個拷貝/μL，靈敏度是普通PCR的100倍;且該qRT-PCR方法特異性強，重復性好，批內和批間變異系數均小于1％。因