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1、目的: 中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin,NGAL)是lipocalin家族的新成員,于1993年在人中性粒細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)眾多研究表明NGAL基因參與若干腫瘤的發(fā)生發(fā)展,可能是人類(lèi)的一種重要的癌基因;Goets等的研究還顯示在細(xì)菌入侵機(jī)體后,NGAL可以作為鐵載體介導(dǎo)阻礙細(xì)菌對(duì)鐵的捕獲,從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng),是一種重要的細(xì)菌抑制劑;NGAL
2、還參與腎小管上皮發(fā)生的及功能調(diào)控,對(duì)急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)等腎臟功能的診斷價(jià)值比傳統(tǒng)的AKI實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)血肌酐更為快速和準(zhǔn)確,是AKI最強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因子。因此對(duì)NGAL基因的檢測(cè)亦顯得尤為重要。本課題研究的目的就是建立NGAL mRNA的熒光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,F(xiàn)Q-PCR)檢測(cè)方法,并將此方法應(yīng)用于臨床結(jié)腸癌患者腫瘤組織、癌旁組織及正常組織NGAL
3、mRNA的檢測(cè),初步驗(yàn)證其應(yīng)用價(jià)值。 方法: 1.根據(jù)NGAL基因序列,設(shè)計(jì)并合成PCR引物,將PCR擴(kuò)增的特異片段克隆入T載體,重組質(zhì)粒經(jīng)篩選、鑒定、定量后作為標(biāo)準(zhǔn)品。 2.在上述NGAL擴(kuò)增片段內(nèi)部設(shè)計(jì)FQ-PCR引物,通過(guò)正交設(shè)計(jì)方式對(duì)PCR引物濃度、退火溫度、SYBRgreenⅠ染料(Mg2+)濃度等PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,從而建立NGALmRNA的檢測(cè)方法。 3.將高濃度標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行系列稀釋?zhuān)?/p>
4、用上述優(yōu)化的FQ-PCR方法進(jìn)行檢測(cè),以NGAL拷貝數(shù)為橫坐標(biāo),循環(huán)閾值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),用于被測(cè)物的絕對(duì)定量。 4.對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行敏感性、特異性及重復(fù)性等方法學(xué)評(píng)價(jià)。 5.將建立的FQ-PCR用于臨床結(jié)腸癌患者腫瘤組織、癌旁組織及正常組織NGALmRNA的檢測(cè),其結(jié)果與普通PCR相比較。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGM-T-NGAL。 2.確立了FQ-PCR最佳反應(yīng)條件:SYBR10
5、×Buffer(withMg2+)2μl、dNTPs0.2mmol/L、上游、下游引物各0.32μmol/ml、SYBRTaqTM1.25μl、ddH2O15.15μl,退火溫度60.0℃。 3.制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)為98.9%,無(wú)非特異性擴(kuò)增。建立了以NGAL mRNA SYB RgreenⅠ染料技術(shù)為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,其線(xiàn)性檢測(cè)范圍為102~109copies/μl;靈敏度為10copies/μl.高拷貝樣品的
6、天間CV為3.57%、批內(nèi)CV為2.95%,低拷貝樣品的天間CV為3,24%、批內(nèi)CV為1.85%;特異性好; 4.對(duì)臨床標(biāo)木的檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期設(shè)想完全相符。腫瘤組織、癌旁組織正常組織的NGAL mRNA水平呈明顯的下降梯度。與普通PCR相比,該檢測(cè)方法靈敏度要高約100倍。 結(jié)論: 我們成功構(gòu)建了FQ-PCR檢測(cè)體系和NGA LmRNA的定量標(biāo)準(zhǔn)品,其快速、靈敏、特異的特點(diǎn)適合臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。為臨床NGAL m
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