UCP2在膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體中的作用及初步機(jī)制探討.pdf

1、目的及意義：
　　本課題在構(gòu)建UCP2過(guò)表達(dá)及RNAi沉默UCP2的穩(wěn)轉(zhuǎn)株心肌細(xì)胞基礎(chǔ)上，用脂多糖及肽聚糖混合制劑刺激細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)心肌細(xì)胞線粒體的形態(tài)，線粒體腫脹度、線粒體膜電位、線粒體ROS及氧化應(yīng)激指標(biāo)、線粒體ATP含量、線粒體mtDNA等指標(biāo)，揭示UCP2在膿毒癥心肌細(xì)胞線粒體中的保護(hù)作用及機(jī)制，為臨床治療膿毒癥時(shí)心肌損傷提供基礎(chǔ)理論支持。
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)分組
　?、賀NA干擾篩選實(shí)驗(yàn)分組:篩選

2、有效的UCP2干擾基因片段。將H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分成五組，分別為:①Control組，給予等量的生理鹽水;②Lipofectamine組，給予等量的Lipofectamine2000;③siRNA1組，給予siRNA1干擾序列;④siRNA2組，給予siRNA2干擾序列;⑤ncRNA組，給予ncRNA序列。上述各siRNA的終濃度為80 nmol/l。
　?、诟蓴_實(shí)驗(yàn)分組:將H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分成四組，分別為:①Control

3、組，給予生理鹽水刺激;②LPS/PepG組，給予LPS及PepG刺激;③LPS/PepG+siRNA組，給予LPS及PepG刺激后予siRNA干預(yù);④LPS/PepG+ncRNA組，給予LPS及PepG刺激后予ncRNA干預(yù)。上述LPS的終濃度為2μg/ml，PepG的終濃度為20μg/ml。
　　③過(guò)表達(dá)細(xì)胞分組:將H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分成四組，分別為:①Control組，給予生理鹽水刺激;②LPS/PepG組，給予LPS及Pe

4、pG刺激;③PHBLV組，空病毒載體轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，然后給予LPS及PepG刺激;④PHBLV-UCP2組，然后給予LPS及PepG刺激UCP2過(guò)表達(dá)H9C2細(xì)胞。上述LPS的終濃度為2μg/ml，PepG的終濃度為20μg/ml。
　　2、RNA干擾實(shí)驗(yàn)
　?、俳Y(jié)合文獻(xiàn)及前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照RNA干擾片段設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)2條RNA干擾片段，先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定有效的siRNA;然后以此siRNA作為干擾片段，進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)

5、;
　?、趯iRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，然后觀察其在膿毒癥條件下，對(duì)線粒體形態(tài)及功能的影響。
　　3、UCP2過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建及穩(wěn)定心肌細(xì)胞株的篩選
　?、偬崛〈笫罂偟腞NA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，調(diào)取UCP2目的基因并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳回收目的基因。pMD19-T載體（克隆載體）與UCP2目的基因的連接，然后轉(zhuǎn)染新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。②從UCP2重構(gòu)的T質(zhì)粒中擴(kuò)增目的基因，然后與慢病毒穿梭載

6、體pHBLV-IRES-ZsGreen-PGK-puro進(jìn)行連接;然后將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化及擴(kuò)增、并測(cè)序。③慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，過(guò)濾并超離心濃縮病毒，并進(jìn)行濃度滴定。④慢病毒感染穩(wěn)定細(xì)胞系，慢病毒感染心肌細(xì)胞后，用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，直至篩選完全。因載體能合成抗篩選藥物的蛋白而得以存活，以空載的細(xì)胞為陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。經(jīng)PCR及WB驗(yàn)證，證實(shí)UCP2過(guò)表達(dá)H9C2細(xì)胞株建立

7、成功，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　4、膿毒癥心肌細(xì)胞模型指標(biāo):CK及LDH，IL-6及TNF-α水平
　　①比色法檢測(cè)肌酸激酶:用多功能酶標(biāo)儀，按照南京建成的檢測(cè)肌酸激酶測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行操作。
　?、诒壬z測(cè)乳酸脫氫酶:用多功能酶標(biāo)儀，按照南京建成的檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
　　③ELISA法檢測(cè)IL-6水平:根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。試劑盒為:Rat Interleukin6(IL-6) E

8、LISA Kit, Cusabio Life Science, Wuhan, China。
　　④ELISA法檢測(cè)TNF-α水平:根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。試劑盒為:Rat TNF-αELISA Kit, Cusabio Life Science, Wuhan, China。
　　5、線粒體形態(tài)分析:電鏡觀察線粒體形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體腫脹度
　?、匐婄R觀察標(biāo)本制備:培養(yǎng)并收集心肌細(xì)胞，先用3％戊二醇固定，再予

9、1％餓酸后固定，用酒精脫水，然后置換、包埋、浸透、包埋。電鏡修塊，在AO超薄切片機(jī)下切1μM的半薄切片，飽和醋酸雙氧鈾染后電鏡下觀察。
　?、诰€粒體腫脹度檢測(cè):采用流式細(xì)胞儀(flow cytometry, FCM)常規(guī)的綠色熒光(FITC-H)和紅色熒光(PI-H)進(jìn)行檢測(cè)，以紅色熒光強(qiáng)度/綠色熒光強(qiáng)度計(jì)算膜電位，比值可間接反映線粒體膜電位變化。以前向角散射(forward scatter,FSC)和側(cè)向角散(sidescatt

10、er, SSC)平均熒光強(qiáng)度的比值(FSC/SSC)反應(yīng)線粒體腫脹度。
　　6、激光共聚焦顯微鏡定性觀察線粒體膜電位與流式細(xì)胞儀定量分析膜電位
　?、偌す夤簿劢癸@微鏡定性觀察線粒體膜電位:采用JC-1染色，原理與流式細(xì)胞儀檢測(cè)一致。在6孔培養(yǎng)板上H9C2心肌細(xì)胞用JC-1進(jìn)行熒光染色，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，紅色熒光與綠色熒光的比例代表了線粒體膜電位。
　?、诹魇郊?xì)胞儀定量分析線粒體膜電位:采用一種陽(yáng)離子脂質(zhì)熒光

11、染JC-1作為檢測(cè)線粒體跨膜電位指示劑。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，在低濃度時(shí)以單體的形式存在，高濃度時(shí)以多聚體形式存在，兩者的發(fā)射光譜不同。根椐這一特征檢測(cè)線粒體膜電位的變化。線粒體膜電位升高時(shí)，JC-1聚合體形式增加，F(xiàn)L-2/FL-1比值升高;線粒體膜電位下降時(shí)，JC-1單體形式增加，F(xiàn)L-2/FL-1比值降低。
　　結(jié)果：
　　1、膿毒癥細(xì)胞模型成功建立:我們用來(lái)自金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上的PepG與來(lái)自革蘭陰

12、性菌LPS組成混合劑，刺激H9C2心肌細(xì)胞后，檢測(cè)到Lps/PepG組細(xì)胞培養(yǎng)液中的CK、LDH、及IL-6、TNF-α的水平明顯高于Control組。Control組線粒體邊界清楚，基質(zhì)均勻，線粒體嵴致密，形態(tài)大致正常。Lps/PepG組線粒體邊界模糊不清，體積明顯腫脹，基質(zhì)密度降低，部分線粒體內(nèi)膜破裂、嵴疏松溶解，甚至嵴斷裂現(xiàn)象，可見(jiàn)空泡樣變。這提示膿毒癥的細(xì)胞模型構(gòu)建成功。
　　2、RNA干擾片段篩選結(jié)果:與Control組

13、相比，SiRNA1組和SiRNA2組UCP2-mRNA基因拷貝數(shù)明顯降低，分別下降了59％和69％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故選擇SiRNA2干擾片段作為后續(xù)UCP2基因干擾實(shí)驗(yàn)。
　　3、UCP2基因的表達(dá)結(jié)果:①干擾實(shí)驗(yàn)顯示:Lps/PepG+siRNA組的UCP2蛋白相對(duì)密度值和UCP2 mRNA表達(dá)相對(duì)拷貝數(shù)均明顯低于Control組及Lps/PepG組;②過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示:PHBLV-UCP2組的UCP2蛋白相對(duì)密度值及UCP2

14、-mRNA相對(duì)拷貝數(shù)均明顯高于Control組及Lps/PepG組。這說(shuō)明干擾實(shí)驗(yàn)及過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)基因構(gòu)建是成功的。
　　4、UCP2沉默及過(guò)表達(dá)對(duì)CK、LDH、及IL-6、TNF-α的水平影響:①干擾實(shí)驗(yàn)顯示:Lps/PepG+siRNA組的CK水平及LDH水平明顯高于Lps/PepG組;Lps/PepG+siRNA組的TNF-α水平及IL-6水平均明顯高于Lps/PepG組，這提示干擾UCP2導(dǎo)致膿毒癥細(xì)胞損傷及炎癥因子釋放進(jìn)一步

15、加重。②過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示:PHBLV-UCP2組的的CK水平和LDH水平均明顯低于Control組及Lps/PepG組;PHBLV-UCP2組的IL-6水平和TNF-α水平均明顯低于Lps/PepG組，這提示UCP2過(guò)表達(dá)抑制膿毒癥細(xì)胞損傷及炎癥因子的進(jìn)一步釋放。
　　5、線粒體腫脹度:①干擾實(shí)驗(yàn)顯示:與Lps/PepG組相比，Lps/PepG+siRNA組FSC/SSC值明顯升高，且線粒體形態(tài)損壞更加明顯，表現(xiàn)為線粒體腫脹明顯，基

16、質(zhì)密度降低顯著，可見(jiàn)內(nèi)膜破裂及嵴斷裂，空泡樣變更加明顯;這提示干擾UCP2導(dǎo)致膿毒癥線粒體損傷加重。②過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示:與Lps/PepG組相比，PHBLV-UCP2組的FSC/SSC值明顯將低，線粒體形態(tài)損壞有所改善，表現(xiàn)為線粒體腫脹減輕，基質(zhì)密度增高，內(nèi)膜破裂及嵴斷裂減少，空泡樣變不明顯;這提示UCP2過(guò)表達(dá)有利于保護(hù)膿毒癥線粒體。
　　6、線粒體膜電位:①干擾實(shí)驗(yàn)顯示:與Lps/PepG組相比，Lps/PepG+siRNA組的

17、紅色熒光/綠色熒光比值明顯增高， MMP明顯增高;②過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示:與Lps/PepG組相比， PHBLV-UCP2組的紅色熒光/綠色熒光比值明顯上升，MMP明顯增高;但PHBLV-UCP2組MMP的幅度沒(méi)有Lps/PepG+siRNA組高。這提示:UCP2可以調(diào)控膜電位水平，但具體調(diào)控程度尚不明確。
　　結(jié)論:
　　UCP2在膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷中起著保護(hù)作用，其機(jī)制可能是:UCP2通過(guò)解耦聯(lián)作用調(diào)控線粒體膜電位，