PRRSV間接免疫熒光方法的建立及感染細(xì)胞過程中亞中和劑量抗體的介導(dǎo)作用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病。該病已經(jīng)引起世界各國(guó)的高度重視,相關(guān)研究也不斷展開,但是它的致病機(jī)理還不是很清楚。目前的一些研究發(fā)現(xiàn)PRRSV感染過程中存在抗體依賴性增強(qiáng)作用現(xiàn)象,亞中和劑量抗體能通過與靶細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合而增強(qiáng)病毒的感染,這可能與病毒的致病性相關(guān)。
　　 本試驗(yàn)用PRRSV Hn/06毒株接種Marc-145細(xì)胞,

2、待出現(xiàn)病變后收集病毒液,滴鼻感染20日齡健康仔豬,10mL/頭,感染后第11天、21天、31天分別用含弗氏不完全佐劑的純化濃縮病毒抗原加強(qiáng)免疫,5mL/頭,感染后45天采血制備免疫血清,經(jīng)ELISA方法檢測(cè),抗體效價(jià)為1:12800,結(jié)果表明成功制備了豬抗PRRSV免疫血清。
　　 用硫酸銨鹽析法粗提健康豬IgG,經(jīng)DEAE-纖維素離子交換層析柱純化,將純化豬IgG免疫兔子,制備兔抗豬免疫血清,經(jīng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定,抗體效價(jià)為1:

3、64。用同樣的方法粗提并純化兔抗豬IgG后,測(cè)蛋白含量,濃縮后用低溫袋內(nèi)標(biāo)記方法標(biāo)記FITC熒光素,在PBS液中透析4h后經(jīng)葡聚糖凝膠層析柱去除游離的FITC分子,紫外分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)記后的兔抗豬熒光二抗,濃度為6.99mg/mL。
　　 在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞,待其K到75％以上單層時(shí)接種PRRSV,培養(yǎng)48h后,用70％冷丙酮溶液固定,PBS液洗滌,將豬抗PRRSV陽(yáng)性血清做一抗,分別作100、200、

4、400、800、1600和3200倍稀釋,用FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG做二抗,分別作10、20、30、40和50倍稀釋,同時(shí)設(shè)陰性血清對(duì)照。按照方陣法確定一抗和二抗的最佳。工作濃度分別為1:800和1:20。結(jié)果表明成功建立了可檢測(cè)PRRSV的間接免疫熒光方法(IFA)。
　　 將豬抗PRRSV免疫血清做1:2、1:4、1:8、1:16、1:32不同稀釋度,分別與等體積的200 TCID50的PRRSV病毒液作用1h后接種豬肺巨

5、噬細(xì)胞(PAM),培養(yǎng)48h后用IFA檢測(cè)PAM中PRRSV,測(cè)定免疫血清的中和效價(jià)為1:4。
　　 本試驗(yàn)將1:8、1:16、1:32三個(gè)稀釋度的亞中和劑量免疫血清與等體積的200 TCID50的PRRSV病毒液作用1 h,制成不同濃度的抗體與病毒的復(fù)合物,然后和等體積的10倍稀釋的豚鼠血清作用1h后接種PAM細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后用IFA檢測(cè)PAM細(xì)胞中PRRSV；同時(shí)將不同濃度的亞中和劑量抗體與病毒的復(fù)合物分別與等體積的10

6、倍稀釋的兔抗豬IgG作用1h后接種PAM細(xì)胞,培養(yǎng)48h后用IFA檢測(cè)PAM細(xì)胞中PRRSV,用PRRSV感染PAM細(xì)胞試驗(yàn)作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示,在補(bǔ)體受體阻斷和Fc受體阻斷試驗(yàn)中,均沒有出現(xiàn)和感染對(duì)照試驗(yàn)一樣的熒光,說明補(bǔ)體和兔抗豬IgG成功阻斷了亞中和劑量抗體與病毒的復(fù)合物進(jìn)入PAM細(xì)胞。
　　 在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)PAM細(xì)胞,24 h后分別將鼠抗豬FcγRⅡB受體胞外區(qū)血清、鼠抗FcγRⅢ受體胞外區(qū)血清及其混合血清加入

7、PAM細(xì)胞,封閉1 h后接種不同濃度的亞中和劑量抗體與病毒的復(fù)合物,培養(yǎng)60h后用IFA和RT—PCR方法分別檢測(cè)PAM中的PRRSV。同時(shí)用健康鼠血清封閉PAM細(xì)胞作陰性對(duì)照,用PRRSV感染PAM細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示,鼠抗豬FcγRⅡB胞外區(qū)血清均能阻斷1:8、1:16和1:32稀釋的三個(gè)亞中和劑量抗體與病毒的復(fù)合物進(jìn)入PAM細(xì)胞,而鼠抗FcγRⅢ胞外區(qū)血清只能夠阻斷1:8稀釋的亞中和劑量的抗體與病毒的復(fù)合物進(jìn)入PAM細(xì)胞,兩種