快速檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒免疫膠體金診斷試紙條的研制.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)屬于動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae),動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)，可引起懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)及斷奶仔豬肺炎、生長(zhǎng)遲緩等癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立能夠?qū)RRSV進(jìn)行現(xiàn)地快速檢測(cè)的、簡(jiǎn)便的診斷方法是十分必要的。 本試驗(yàn)采用差速離心和蔗糖密度梯度離心法純化病毒抗原，按常

2、規(guī)方法免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)融合小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞，融合率為91.4％。用建立間接ELISA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清，結(jié)果陽(yáng)性率為20.6％。采用有限稀釋法進(jìn)行3次克隆，獲得了5株抗PRRSV單克隆抗體(McAb)，分別命名為D5、D7、D10、E9和B5。5株McAb腹水的效價(jià)分別為1:25600、1:12800、1:6400、1:12800和1:6400。免疫球蛋白亞類鑒定結(jié)果顯示，D5和B5屬于IgG2b亞

3、類，D7、D10和E9屬于IgM亞類，而其輕鏈均為κ鏈。用原核表達(dá)的PRRSVN蛋白對(duì)家兔進(jìn)行多次免疫，制備了兔抗PRRSVN蛋白抗體。 免疫膠體金診斷試紙條具有快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合單克隆抗體技術(shù)又有良好的特異性和敏感性，是目前現(xiàn)地應(yīng)用最廣泛的一種診斷方法。本試驗(yàn)利用檸檬酸三鈉還原法制備粒徑約為20nm的膠體金，選擇抗體效價(jià)高，反應(yīng)活性好且亞類為IgG2b的D5McAb與20nm的膠體金顆粒結(jié)合制備探針，同時(shí)將純化的兔抗PRR

4、sVN蛋白抗體和羊抗鼠lgG包被硝酸纖維素膜(NCM)分別作為檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，組裝成檢測(cè)PRRSV的免疫膠體金診斷試紙條。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)組裝的免疫膠體金診斷試紙條可以檢出6.25μg/mL純化的PRRSV抗原。在特異性試驗(yàn)中，用所組裝的試紙條對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬細(xì)小病毒(PPV)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，該試紙條只能夠