應(yīng)用多模態(tài)成像評價腫瘤血管靶向肽GEBP11的胃癌放射性靶向治療.pdf

1、背景：
　　腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程依賴于新生血管的形成，抑制腫瘤血管形成及增生就成為腫瘤成像和治療的有效靶點。在過去的幾十年中，大量的工作都集中于研究發(fā)現(xiàn)血管生成抑制劑。由于目前的血管生成抑制劑多分子量較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、成本偏高等原因，其應(yīng)用受到較大程度地限制。短肽具有良好的組織滲透性、代謝穩(wěn)定性及可耐受多種修飾等特點，以短肽為基礎(chǔ)的腫瘤血管靶向治療成為研究的熱點。聚乙二醇化、脂質(zhì)體包被及與放射性核素螯合形成絡(luò)合物是短肽常用的修飾方式。

2、將腫瘤靶向性短肽進行放射性核素標記治療腫瘤，既可以特異持久的殺傷腫瘤細胞，又可避免損傷正常組織及器官，具有毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢。目前，多種利用短肽制備的放射性靶向藥物正在研究中，而且一部分藥物已經(jīng)進入臨床試驗階段。
　　前期工作中，實驗室應(yīng)用噬菌體環(huán)七肽庫篩選出能夠與腫瘤血管特異結(jié)合的短肽GEBP11,成功標記131Ⅰ后制備形成131Ⅰ-GEBP11，動物實驗顯示出良好的抗瘤作用，并且有較輕的毒副作用。但GEBP11短

3、肽仍有一些不足，如循環(huán)半衰期短、受體親和力不夠強、瘤內(nèi)濃聚度欠佳等，因此131Ⅰ-GEBP11的成藥性尚不理想。本研究擬采用化學修飾的方法提高該短肽的循環(huán)半衰期及受體親和力，并應(yīng)用修飾后的短肽2PEG-(GEBP11)3制備同位素探針進行放射性成像及治療，旨在為開發(fā)安全高效的胃癌血管靶向治療藥物提供候選分子。
　　目的：
　　1.化學合成2PEG-(GEBP11)3多聚體短肽并鑒定其受體親和力、結(jié)合特異性。
　　2.制

4、備2PEG-(GEBP11)3多聚體短肽同位素探針，并鑒定其體內(nèi)腫瘤血管靶向性，評價其在腫瘤多模態(tài)成像和放射性靶向治療中的價值。
　　方法：
　　1.利用叉形PEG合成三聚體短肽2PEG-(GEBP11)3，應(yīng)用質(zhì)譜進行鑒定；應(yīng)用Iodogen方法131Ⅰ直接標記GEBP11及2PEG-(GEBP11)3，并進行標記率、放射化學純度及穩(wěn)定性分析；細胞免疫熒光進一步鑒定 GEBP11短肽與Co-HUVECs結(jié)合的特異性；競爭性

5、結(jié)合實驗及放射自顯影比較鑒定2PEG-(GEBP11)3、GEBP11短肽與Co-HUVECs的親和力差異。
　　2.利用2PEG-(GEBP11)3及GEBP11短肽制備同位素探針進行SPECT和切倫科夫成像以及生物學分布測定，比較兩種放射性示蹤劑在荷瘤鼠體內(nèi)腫瘤血管靶向性的差異。
　　3.比較放射性131I標記的GEBP11及2PEG-(GEBP11)3短肽對Co-HUVECs及荷瘤鼠腫瘤的抑制作用；病理學H&E染色、免

6、疫組織化學及TUNEL實驗檢測治療后腫瘤組織的細胞凋亡及血管數(shù)量的改變。
　　結(jié)果：
　　1.質(zhì)譜結(jié)果確定應(yīng)用叉形PEG合成的短肽為2PEG-(GEBP11)3。細胞免疫熒光顯示 GEBP11短肽可特異地與 Co-HUVECs結(jié)合，而在 HUVECs、SGC7901細胞上呈陰性或弱陽性反應(yīng)。應(yīng)用直接法將131I標記 GEBP11及2PEG-(GEBP11)3，紙層析法測定其標記率達93-98％，比活度大于10Ci/mmol；

7、將放射性標記的GEBP11短肽室溫下放置，與血清、生理鹽水、半胱氨酸及EDTA分別混合孵育，24小時后各混合液的標記率均大于83％，表明放射性標記的GEBP11短肽在體內(nèi)外具有良好的穩(wěn)定性。競爭性結(jié)合實驗及放射自顯影顯示2PEG-(GEBP11)3較單體GEBP11與Co-HUVECs具有更高的親和力，且該標記過程對短肽的親和力無明顯影響。
　　2.將放射性核素131Ⅰ標記的GEBP11注入到荷瘤鼠體內(nèi)，進行多模態(tài)成像及動態(tài)觀測，

8、在荷瘤鼠腫瘤部位可見有放射性濃聚灶，且131Ⅰ-2PEG-(GEBP11)3在荷瘤鼠的腫瘤部位濃聚性最高，4h時顯影最清晰，而131I-URP對照組無腫瘤部位的特異性濃聚。生物學分布結(jié)果顯示131Ⅰ-2PEG-(GEBP11)3在腫瘤組織的放射性高于胃腸、肌肉等正常組織，腫瘤組織4h的放射性為2.22±0.13％ID/g，24h后緩慢降至1.61±0.05％ID/g，而131I-2PEG-(GEBP11)3在正常組織器官很快清除。

9、>　　3.體外細胞毒性和細胞凋亡實驗顯示放射性標記的GEBP11短肽可產(chǎn)生細胞毒及細胞凋亡作用，呈濃度依賴性，且131Ⅰ-2PEG-(GEBP11)3的作用較強，Na131Ⅰ對 Co-HUVECs無特異性細胞凋亡及殺傷作用。抑瘤結(jié)果顯示131Ⅰ-2PEG-(GEBP11)3的腫瘤抑制作用最強，其次為131Ⅰ-GEBP11,而131Ⅰ-URP有輕微的抑瘤作用。與對照組相比，131Ⅰ-GEBP11治療組裸鼠的生存時間從35天延長為51天，1

10、31Ⅰ-2PEG-(GEBP11)3治療組裸鼠的生存期延長為75天。免疫組織化學結(jié)果顯示，與對照組相比，放射性標記的GEBP11短肽治療組腫瘤部位血管數(shù)量減少，以131Ⅰ-2PEG-(GEBP11)3治療組腫瘤血管數(shù)量減少明顯。H&E染色及TUNEL實驗顯示131Ⅰ-2PEG-(GEBP11)3治療后瘤內(nèi)可見大片狀壞死，131Ⅰ-GEBP11治療后瘤內(nèi)可見局灶性小片狀壞死；而131Ⅰ-URP及對照組腫瘤細胞生長良好。各治療組無明顯肝腎毒

11、性。
　　結(jié)論：
　　1.應(yīng)用Iodogen直接法標記GEBP11短肽，獲得標記率、比活度高，穩(wěn)定性良好的放射性探針，且131Ⅰ-2PEG-(GEBP11)3與胃癌血管內(nèi)皮細胞的親和力、特異性高于131Ⅰ-GEBP11。
　　2.與131Ⅰ-GEBP11相比，131Ⅰ-2PEG-(GEBP11)3具有更高的腫瘤血管靶向性，可特異性的聚集在腫瘤部位，其體內(nèi)半衰期明顯延長，能顯著抑制腫瘤生長，無明顯肝腎毒副作用。因此131