胃癌血管靶向肽GX1修飾的人血清白蛋白用于胃癌近紅外活體成像.pdf

1、胃癌是我國(guó)的常見(jiàn)腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人民群眾的身體健康。胃癌患者5年生存率嚴(yán)重依賴(lài)于診斷時(shí)分期，但是，早期胃癌常無(wú)典型癥狀，發(fā)病隱匿，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于疾病晚期，提高胃癌早期診斷的敏感度和特異性成為重要課題。目前，胃癌早期診斷依賴(lài)于內(nèi)鏡下活檢結(jié)合免疫組織化學(xué)染色檢查，診斷的敏感性和特異性有待進(jìn)一步提高。在胃癌的早期診斷方式中，使用內(nèi)窺鏡有特殊的優(yōu)勢(shì)，特別是使用內(nèi)窺鏡結(jié)合光學(xué)分子影像技術(shù)，在細(xì)胞和分子水平靶向腫瘤成像，可以進(jìn)一步提高診斷

2、的敏感性和特異性，因而成為關(guān)注的焦點(diǎn)，而分子探針是成功進(jìn)行分子影像成像的關(guān)鍵之一。雖然已研究出多種探針成功用于小動(dòng)物活體成像，但是由于毒性高、靶向特異性低、儀器設(shè)備和探針成本高昂等原因，難以用于臨床。因此，合成安全、具有較高生物相容性、低成本、高效靶向特異性并且具有一定臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化能力的胃癌靶向分子探針具有重要意義。近紅外熒光（near-infrared fluorescence，NIRF）成像，是具有活體自發(fā)熒光影響少、組織對(duì)光散射較

3、弱，良好的組織穿透性，以及成像設(shè)備可結(jié)合內(nèi)窺鏡應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)的光學(xué)成像方式。GX1為隨機(jī)噬菌體肽庫(kù)體內(nèi)篩選法在活體內(nèi)所篩選出的環(huán)狀短肽，前期研究已證實(shí)GX1在活體內(nèi)具有良好的胃癌血管靶向性，并可攜帶核素或者熒光染料進(jìn)行活體成像。FDA所批準(zhǔn),臨床用于血管成像的近紅外熒光染料吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）為常見(jiàn)的NIRF成像示蹤劑，內(nèi)源性蛋白人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）可以作為ICG的

4、載體。
　　【目的】
　　以HSA作為ICG的載體，GX1對(duì)HSA進(jìn)行表面修飾，合成胃癌血管靶向特異性的近紅外熒光探針GX1-HSA-ICG，對(duì)其進(jìn)行表征，并研究其作為近紅外熒光探針在體外細(xì)胞和荷人胃癌裸鼠活體中的靶向成像能力。
　　【方法】
　　1. HSA作為ICG載體，在EDC和sulfo-NHS活化下GX1與HSA共價(jià)連接，合成GX1-HSA-ICG納米顆粒探針；
　　2.使用 SDS-PAGE和考

5、馬斯亮藍(lán)染色對(duì)探針合成進(jìn)行鑒定；紫外-可見(jiàn)光譜掃描以確認(rèn)HSA與ICG的連接；動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定探針的水合尺寸和ζ系數(shù)；
　　3.利用臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定與GX1-HSA-ICG共孵育的 GES細(xì)胞存活率，評(píng)估GX1-HSA-ICG的細(xì)胞毒性；
　　4.使用探針與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC以及與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 Co-HUVEC進(jìn)行結(jié)合和競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)，加入未標(biāo)記的 GX1與GX1-HSA-ICG競(jìng)爭(zhēng)Co-HUVEC上的結(jié)合

6、位點(diǎn)，驗(yàn)證探針和Co-HUVEC細(xì)胞結(jié)合的特異性；
　　5.經(jīng)尾靜脈注射GX1-HSA-ICG，使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)（IVIS系統(tǒng)）對(duì)皮下荷胃癌小鼠進(jìn)行近紅外熒光活體成像，驗(yàn)證探針在體內(nèi)的胃癌靶向性。
　　6.體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)觀察探針的腫瘤靶向特異性以及代謝器官。
　　【結(jié)果】
　　1.成功合成 GX1-HSA-ICG，SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示GX1-HSA-ICG為較 HSA-ICG分子量

7、更大的條帶；紫外-可見(jiàn)光吸收光譜結(jié)果顯示GX1-HSA-ICG的吸收峰在280nm和800nm處；動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果顯示GX1-HSA-ICG的水合粒徑增加至81±4.3nm，澤塔系數(shù)為-35±0.4mV。
　　2. GES細(xì)胞分別與以下溶液共孵育4小時(shí)，在PBS組、ICG組、HSA-ICG組和GX1-HSA-ICG組的存活率分別為96±1.52％，95±1.15%，95±1.37%，96±1.78%，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　3.細(xì)

8、胞結(jié)合與競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)顯示，在ICG組、HSA-ICG組、GX1-HSA-ICG組、封閉組，HUVEC細(xì)胞與Co-HUVEC細(xì)胞組的平均輻射效率[p/sec/cm2/sr]/[μW/cm2]分別為：3.09±1.09×108 vs3.76±1.21×108，1.54±0.21×108 vs1.78±0.09×109，8.83±0.83×108 vs1.51±0.01×109，1.93±0.27×108 vs2.31±0.36×108，在G

9、X1-HSA-ICG組Co-HUVEC細(xì)胞的平均輻射效率較HUVEC細(xì)胞顯著增強(qiáng)（P<0.01）；
　　4.荷胃癌小鼠活體成像結(jié)果顯示，第24小時(shí)的腫瘤與背景的平均熒光信號(hào)強(qiáng)度比（TBR），GX1-HSA-ICG(7.81±0.32)組和ICG組(3.62±0.16)、HSA-ICG組(3.51±0.23)、Block組(2.89±0.71)比較，顯著增強(qiáng)（P<0.01）；
　　5.探針的體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)顯示腫瘤部位與背景的平均

10、熒光信號(hào)強(qiáng)度比在ICG組、HSA-ICG組、GX1-HSA-ICG組和Block組分別為：7.53±1.11，11.43±1.30，22.20±1.09和7.11±0.20，探針組較其他組顯著升高（P<0.01）,而肝臟局部TBR值在所有器官中最高。
　　【結(jié)論】
　　1.成功合成胃癌血管靶向肽GX1修飾的HSA為近紅外熒光染料ICG載體的胃癌血管靶向探針GX1-HSA-ICG；
　　2.體外實(shí)驗(yàn)提示GX1-HSA-I