水通道蛋白-1（AQP-1）在大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷發(fā)病機(jī)制中的作用及中藥清胰湯對(duì)其影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:重癥急性胰腺炎(severe acute panereatitis，SAP)發(fā)病急劇，病情兇險(xiǎn)，早期即可合并急性肺損傷(acute lung injury,ALI)而導(dǎo)致死亡。SAP誘發(fā)ALI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，以往的研究認(rèn)為由于細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放影響了肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性而導(dǎo)致了以肺水腫為主要病理特征的ALI。水通道蛋白-1(aquaporin-1，AQP-1)是廣泛分布于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種細(xì)胞膜蛋白，與肺水的轉(zhuǎn)運(yùn)

2、密切相關(guān)。目前的資料顯示，AQP-1參與了多種肺水腫性疾病的病理過(guò)程，但是在SAP誘發(fā)ALI的發(fā)病機(jī)制中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。 由于SAP誘發(fā)ALI的機(jī)制復(fù)雜，故目前尚未有一種特效的治療方法，目前多主張綜合的個(gè)體化治療方案。其中，中藥清胰湯對(duì)胰腺炎的治療已經(jīng)取得了非常好的治療效果，但對(duì)AQP-1在肺組織中表達(dá)的影響，卻少見(jiàn)報(bào)道。本課題通過(guò)觀察AQP-1在重癥急性胰腺炎大鼠肺組織的表達(dá)和功能改變，以及中藥清胰湯對(duì)其表達(dá)的影響，從新的角

3、度探討SAP誘發(fā)ALI的發(fā)病機(jī)制，為臨床更好地治療ALI提供理論依據(jù)。 方法: 實(shí)驗(yàn)一：將健康Wistar大鼠隨機(jī)分為2組，每組24只：假手術(shù)組(SHAM組)，重癥急性胰腺炎肺損傷組(ALI組)。以15g/L。去氧膽酸鈉溶液逆行注入胰膽管誘發(fā)ALI模型。SHAM組剖腹后只翻動(dòng)胰腺，不注射藥物。動(dòng)物模型建立后，分別于術(shù)后4h、8h和12h每組各取8只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。留取動(dòng)脈、靜脈血備用。計(jì)算肺干濕比。取肺組織切片進(jìn)行病理檢查

4、。血?dú)夥治鰞x檢測(cè)動(dòng)脈血?dú)夥治?。血清淀粉酶水平測(cè)定采用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。RT-PCR檢測(cè)肺組織AQP-lmRNA表達(dá)。免疫組化法檢測(cè)肺組織中AQP-1的表達(dá)，每只大鼠取3張切片進(jìn)行圖象分析，求其平均灰度。Westernblot法檢測(cè)肺組織 AQP-1 水平。試驗(yàn)二：48只造模后的Wistar大鼠隨機(jī)分為肺損傷組(ALI組)和地塞米松組(DEX組)，每組24只。另取24只Wistar大鼠作為假手術(shù)組(SHAM組)。DEX組在造模后立即于股

5、靜脈注射地塞米松 2mg/kg。動(dòng)物模型建立后，分別于術(shù)后4h、8h和12h每組各取8只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。留取動(dòng)脈、靜脈血備用。計(jì)算肺干濕比。取肺組織切片病理檢查。血?dú)夥治鰞x檢測(cè)動(dòng)脈血?dú)?。血清淀粉酶水平測(cè)定采用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。RT-PCR檢測(cè)肺組織AQP-1mR_NA表達(dá)。免疫組化法檢測(cè)肺組織中 AQP-1 的表達(dá)，每只大鼠取3張切片進(jìn)行圖象分析，求其平均灰度。Western blot法檢測(cè)肺組織 AQP-1 水平。采用放免法測(cè)定血清

6、TNF-α水平測(cè)定。 試驗(yàn)三：32只Wistar大鼠隨機(jī)分四組：假手術(shù)組(SHAM組)，胰腺炎肺損傷組(ALI組)、地塞米松治療組(DEX組)和清胰湯治療組(QYT組)，每組8只。ALI模型制備：以 15g/L 的去氧膽酸鈉逆行注入胰膽管誘發(fā)胰腺炎肺損傷模型：SHAM組只在剖腹后翻動(dòng)胰腺；DEX組在造模后立即于股靜脈注射地塞米松 2mg/kg；QYT 組于造模后立即予清胰湯以1 ml/100g灌胃。各組在造模后8小時(shí)剖殺，腹主動(dòng)

7、脈及下腔靜脈采血，動(dòng)脈血立即行血?dú)夥治?，靜脈血離心后血清置-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。?jì)算肺干濕比。取肺組織切片病理檢查。血?dú)夥治鰞x檢測(cè)動(dòng)脈血?dú)?。血清淀粉酶水平測(cè)定采用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。免疫組化法檢測(cè)肺組織中 AQP-1 的表達(dá)，每只大鼠取3張切片進(jìn)行圖象分析，求其平均灰度。采用放免法測(cè)定血清 TNF-α水平測(cè)定。RT-PCR檢測(cè)肺組織AQP-1mRNA表達(dá)。Westernblot法檢測(cè)肺組織 AQP-1 水平。 結(jié)果: 1

8、．實(shí)驗(yàn)一：與SHAM組相比，ALI模型組肺組織鏡下表現(xiàn)為肺間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大部分肺泡間隔明顯增寬，肺間質(zhì)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。ALI組肺濕/干重比明顯增加，并隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重(P<0.01)，動(dòng)脈血?dú)馓崾狙醴謮好黠@低于SHAM組(P<0.01)，血淀粉酶水平顯著升高(P<0.01)。SHAM組肺組織可見(jiàn)AQP-1mRNA表達(dá)，但ALI組AOP-1mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，并且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，肺濕/干重比逐漸增加、血淀粉酶水平逐漸升高而

9、下調(diào)趨于嚴(yán)重(P<0.01)。免疫組化結(jié)果、Westernblot結(jié)果提示ALI組肺組織AQP-1的蛋白表達(dá)較SHAM組明顯下調(diào)(P<0.01)，與AQP-1mRNA表達(dá)結(jié)果相一致。 2．實(shí)驗(yàn)二：與血淀粉酶的升高、動(dòng)脈血氧分壓的下降、肺水腫的加重相對(duì)應(yīng)，ALI組血清中 TNF-α的水平隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高。與ALI組相比，DEX組血清TNF-α明顯減低，差異具有顯著性(P<0．05)。ALI組，隨著TNF-α的升高，肺組織AQP

10、-1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)逐漸下降，而DEX組肺組織AQP-1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)較ALl組明顯上調(diào)(P<0.05)，提示肺組織AQP-1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)與血清FNF-α水平呈負(fù)的線性關(guān)系。 3．實(shí)驗(yàn)三：與實(shí)驗(yàn)一、二的結(jié)果一致，ALI組肺濕/干重比、血淀粉酶水平、TNF-α的升高水平較SHAM組具有顯著差異(P<0.01)，肺組織AQP-1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平較SHAM組明顯下調(diào)(JF)<0.01)。而DEX組與O

11、YT組肺濕/干重比、血淀粉酶水平、FNF-α的升高水平較ALI組顯著下降(P<0.05)，肺組織AQP-1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平較ALI組明顯上調(diào)(P<0.05)。QYT組與DEX組相比，兩組的各種檢測(cè)數(shù)據(jù)相近。 結(jié)論: AQP-1是分布在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種細(xì)胞膜蛋白，其功能是參與肺水的快速轉(zhuǎn)運(yùn)，因此，AQP-1在肺組織中的表達(dá)水平與肺水轉(zhuǎn)運(yùn)，尤其是病理?xiàng)l件下的肺水轉(zhuǎn)運(yùn)是密切相關(guān)的。以往的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)AQP-1

12、參與了多種肺水腫性疾病的病理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)一的結(jié)果提示，隨著肺損傷的出現(xiàn)、肺水腫的加重，肺組織AQP-1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，證實(shí)了AQP-1在肺組織中的表達(dá)與肺水．腫的形成有關(guān)。AQP-1參與了重癥急性胰腺炎誘發(fā)急性肺損傷的病理過(guò)程。 SAP誘發(fā)ALI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前的研究多認(rèn)為由于炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的過(guò)度釋放，改變了肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性而發(fā)生肺水腫。其中TNF-α被視為最重要的炎癥介質(zhì)之一，其出現(xiàn)及水平

13、的高低可作為判斷sAP預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)二的結(jié)果可見(jiàn)，ALI組血清’TNF-α升高，AQP-1在肺組織中的表達(dá)下調(diào)，肺水腫加重。而DEX組，由于地塞米松抑制了TNF-α的過(guò)度釋放，肺組織中AQP-1的表達(dá)上調(diào)，肺水腫隨之減輕。TNF-α的水平與AQP-1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，可能是’FNF-α通過(guò)某種途徑抑制了AQP-1的基因轉(zhuǎn)錄，從而影響了AQP-1在肺組織中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)二同時(shí)進(jìn)一步證實(shí)了AQP-1參與了重癥急性胰腺炎誘發(fā)急性肺損傷的病理過(guò)程

14、。 中藥清胰湯治療SAP誘發(fā)的ALI有顯著效果，但作用機(jī)制不甚明確。我們將中藥清胰湯用于治療SAP誘發(fā)的大鼠ALI，并設(shè)立陰性對(duì)照組(SHAM組)和陽(yáng)性對(duì)照組(DEX組)，通過(guò)觀察中藥清胰湯對(duì)肺組織AQP-1表達(dá)的影響探討其治療機(jī)制。結(jié)果表明，中藥清胰湯可以明顯減輕SAP大鼠ALI的程度，并通過(guò)抑制TNF-α的過(guò)度釋放，上調(diào)肺組織AQP-1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)來(lái)達(dá)到治療目的。因此我們推測(cè)，調(diào)節(jié)肺組織AQP-1 的表達(dá)是中藥清