IL--8在重癥急性胰腺炎肺損傷發(fā)病機制中的作用及清胰顆粒干預(yù)的實驗研究.pdf

1、急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床上常見的急腹癥之一，10％～30％的患者會發(fā)展成重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)。急性肺損傷（acute lung injury，ALI）則是SAP中常見的并發(fā)癥之一。胰管梗阻、膽汁反流、過量飲酒、微循環(huán)障礙、高脂血癥、細菌感染是導(dǎo)致AP發(fā)生的主要原因，同時內(nèi)毒素的移位、炎性細胞的激活、多種炎癥因子的瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)等則會使其發(fā)展為全

2、身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）和多器官功能障礙綜合癥(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。在AP過程中，由于PMN侵入肺部，胰彈力蛋白酶、NF-κB通路等的激活使肺部組織受損從而引發(fā)ALI。大量實驗結(jié)果顯示肺毛細血管內(nèi)、肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)的中性粒細胞(neutrophil，PMN)的數(shù)量與ALI/ARDS的嚴重程度呈

3、正相關(guān);PMN被抑制或清除，肺損傷的嚴重程度會明顯的降低，否則，ALI將會迅速發(fā)生。以上這些都表明在相關(guān)的急性肺損傷的發(fā)展過程中PMN起到了非常重要的作用：①PMN活化后可以激活腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor，TNF-α)、白細胞介素1(Interleukin1，IL-1)、白細胞介素6(Interleukin6，IL-6)等炎性因子和趨化因子中的白細胞介素8(Interleukin8，IL-8)，炎性因子

4、會降低PMN變形能力從而使其大量積壓在肺內(nèi)微血管中，并且PMN可以通過多種炎癥通路使機體內(nèi)更多炎性因子被激活導(dǎo)致級聯(lián)反應(yīng)，加重病情;IL-8則可以使PMN黏附內(nèi)皮細胞的數(shù)量增加，引導(dǎo)PMN大量聚集到炎癥位置，促使PMN釋放有害物質(zhì)對機體造成損傷;②PMN釋放損傷性酶如膠原酶、組織蛋白酶、彈性蛋白酶等，膠原酶可以降解和消化肺組織中的結(jié)構(gòu)蛋白，使肺泡毛細血管的基底膜受到破壞;組織蛋白酶可以降低內(nèi)皮細胞的表面抗凝力使PMN更易黏附，并使凝血功

5、能受損;彈性蛋白酶可以改變肺泡通透性引起肺水腫，破壞肺微血管內(nèi)皮細胞使PMN更易通過，破壞肺泡上皮細胞引起表面活性降低，破壞凝血因子造成凝血障礙③PMN可以降低血漿對活性氧自由基的抵抗作用，使活性氧自由基增多，對機體的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)造成不同程度的損傷，其氧代謝產(chǎn)物可以使脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)從而對生物膜脂質(zhì)造成損害，還可以通過改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和酶的活性來影響膜蛋白，也可以使細胞發(fā)生死亡或是降低機體的抗氧化能力;④PMN影響ALI/ARDS是通過

6、對NF-κB通路的調(diào)控作用。
　　在SAP-ALI中，PMN發(fā)生黏附，游出，并大量聚集在炎癥部位。細胞粘附分子1(ICAM-1)與CD11/CD18相互作用，提高了內(nèi)皮細胞與PMN的相互作用。PMN通過釋放炎癥因子損傷肺泡上皮細胞，致其通透性增大，肺表面活性物質(zhì)被分解，從而使肺泡順應(yīng)性降低、表面張力增加，使吸氣時消耗更多能量。由于PMN向炎癥部位聚集，組織中PMN的數(shù)量也將隨之增加，而且其中的炎癥介質(zhì)使其凋亡銳減，這就使PMN持續(xù)

7、被激活，最終引起SIRS。
　　由于IL-8的作用CD11/CD18會從PMN的細胞內(nèi)庫轉(zhuǎn)移到細胞表面，同時PMN表面的L-選擇素也會因為IL-8的影響發(fā)生脫落、變形。IL-8作為CXC趨化家族蛋白之一，其核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的結(jié)合位點與IL-6相近，可在TNF-α的誘導(dǎo)下由血管內(nèi)皮細胞(VEC)產(chǎn)生。骨髓中的PMN可在IL-8的刺激誘導(dǎo)下向外周血釋放。IL-8與CXCR1/CXCR2結(jié)合后，趨化PMN移動到創(chuàng)傷位置并與

8、VEC粘附，從而加重炎癥反應(yīng)。
　　本課題組多年的臨床和基礎(chǔ)實驗研究表明，中藥清胰湯具有通里攻下、清熱解毒、活血化瘀、疏肝理氣的功效，能有效地防治急性胰腺炎及其所引起的肺損傷，目前已廣泛應(yīng)用于臨床并取得了良好的效果。其組方中的大黃和柴胡是通里攻下、疏肝理氣之主藥，也是《金匱要略》經(jīng)典方-大柴胡湯的組成藥味，為治療少陽陽明證的經(jīng)典方劑。多年來的研究證實，清胰湯可以抑制AP所致炎癥反應(yīng)的加重，保護主要器官，防止其功能衰竭。盡管清胰湯治

9、療SAP的實驗研究和臨床觀察被廣泛報道，且AP的發(fā)病機理的研究以及清胰湯的治療作用已經(jīng)取得了較大的進展，但AP-ALI的發(fā)病機理及清胰湯的但其具體干預(yù)機制尚未完全明了，特別是眾多炎癥因子基因及蛋白的表達、信號傳導(dǎo)以及相互關(guān)系還需進一步深入探討。在本試驗中，使用經(jīng)過對清胰湯進行劑型改革制成的顆粒劑——清胰顆粒代替清胰湯進行相關(guān)觀察研究。
　　目的：本實驗應(yīng)用經(jīng)膽胰管逆行注射脫氧膽酸鈉來制備大鼠急性胰腺炎模型，探究IL-8對中性粒細胞

10、的趨化機制及其在急性胰腺炎肺損傷發(fā)病機制中的作用，并觀察清胰顆粒的干預(yù)作用，為臨床上用中西醫(yī)結(jié)合的方法治療重癥急性胰腺炎及其相關(guān)性肺損傷提供可靠的實驗依據(jù)及理論基礎(chǔ)。
　　方法：將50只SPF級雄性SD大鼠隨機分成5組：正常對照組（SHAM組）8只，重癥急性胰腺炎模型組（SAP組）10只，IL-8抗體組（IL-8Ab組）10只，地塞米松組（DEX組）10只，清胰顆粒組（QYKL組）12只。SHAM組僅開腹翻動胰腺數(shù)次;SAP模型組

11、采用15g/L脫氧膽酸鈉（1mL/kg體質(zhì)量）經(jīng)膽胰管逆行注射法制備SAP動物模型;IL-8Ab組為造模后立即經(jīng)尾靜脈注射給予IL-8抗體干預(yù);DEX組為造模后立即經(jīng)腹腔給予5g/L地塞米松注射液;QYKL組為造模前30min用清胰顆粒水溶液進行灌胃。所有組別的大鼠于手術(shù)后24小時進行處死、取材，將部分肺和胰腺組織進行蘇木精一伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色并進行相應(yīng)的病理評分;使用真空干燥法測量肺

12、組織的濕/干比值;先用經(jīng)肝素潤過的5mL注射進行腹主動脈取血，抽取2mL后拔出迅速封閉注射器并送往檢驗科進行血氣分析，同時用血管夾夾死動脈;然后用新的5mL注射器在血管夾上側(cè)插入繼續(xù)取血，提取血清并用ELISA法來測定其中TNF-α、IL-8的含量;全自動生化分析儀檢測血清淀粉酶的含量;Western-Blot法檢測肺組織中ICAM-1蛋白水平的表達;應(yīng)用RT-qPCR檢測肺組織中ICAM-1基因水平的表達。
　　結(jié)果：與SHAM

13、組相比，SAP組大鼠肺和胰腺組織的病理評分均升高(p＜0.05)，符合SAP-ALI的病理學(xué)特征;SAP組動脈血PaO2明顯降低(p＜0.05)，PaCO2顯著升高(p＜0.05);SAP組大鼠的肺組織的濕/干比值顯著升高(p＜0.05);SAP組大鼠血清TNF-α、IL-8的含量均上升(p＜0.05);肺組織的ICAM-1蛋白表達水平升高(p＜0.05);肺組織中ICAM-1的基因表達水平也有所升高(p＜0.05)。與SAP組相比，中

14、藥治療組及IL-8和地塞米松處理組各項指標均有不同程度改善，但可以看到，IL-8和地塞米松不僅作用單一且有一定的副作用，而清胰湯則具有多方面、多層次、多靶點的綜合治療效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　(1)造模后模型組大鼠胰腺和肺組織出現(xiàn)明顯病理改變，血清淀粉酶明顯升高，血氣分析出現(xiàn)明顯變化，肺濕/干比值明顯升高，模型大鼠發(fā)生急性胰腺炎并出現(xiàn)了肺損傷，表明急性胰腺炎肺損傷模型制備成功。
　　(2)清胰顆?？赡芡ㄟ^抑制IL-8的趨