TIMP-3基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、目的：
　　建立以真核表達(dá)載體介導(dǎo)的過表達(dá) TIMP-3基因的肝癌細(xì)胞株（SMMC-7721和HepG2），研究TIMP-3基因?qū)筛伟┘?xì)胞增殖、凋亡、生長(zhǎng)周期、侵襲、遷移等細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
　　方法：
　　1.研究質(zhì)粒 pCMV6-AC-GFP/TIMP-3（TIMP-3）和陰性對(duì)照質(zhì)粒pCMV6-AC-GFP（NC）的擴(kuò)增和鑒定：把 TIMP-3質(zhì)粒和NC質(zhì)粒稀釋后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中擴(kuò)增，測(cè)序鑒定后提取純凈無內(nèi)

2、毒素的TIMP-3質(zhì)粒和NC質(zhì)粒，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.用擴(kuò)增后的TIMP-3質(zhì)粒和NC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染兩肝癌細(xì)胞株，因用800μg/ml G418連續(xù)篩選2周后，NC組細(xì)胞均死亡，故降低G418濃度至400μg/ml繼續(xù)篩選2周，成功構(gòu)建陽性單細(xì)胞克隆，用Western Blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中TIMP-3蛋白表達(dá)。
　　3.利用MTS增殖實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)TIMP-3基因穩(wěn)定表達(dá)后肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
　　4.

3、利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)TIMP-3基因穩(wěn)定表達(dá)后的肝癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化情況。
　　5.利用Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TIMP-3基因穩(wěn)定表達(dá)后的肝癌細(xì)胞侵襲能力和遷移能力變化。
　　結(jié)果：
　　1.TIMP-3質(zhì)粒和NC質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)至大腸桿菌中，與原始序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果完全一致，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.利用非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑把TIMP-3質(zhì)粒和NC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染兩肝癌細(xì)胞株，得到穩(wěn)定高表達(dá) T

4、IMP-3的單克隆陽性細(xì)胞株。命名為 TIMP-3組 SMMC-7721及HepG2細(xì)胞，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載的細(xì)胞命名為空白對(duì)照組SMMC-7721及HepG2細(xì)胞。經(jīng)Western blot證實(shí)TIMP-3組細(xì)胞表達(dá)TIMP-3蛋白，而NC組細(xì)胞則沒有TIMP-3蛋白表達(dá)。
　　3.MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示TIMP-3組SMMC-7721及HepG2細(xì)胞增殖力顯著弱于NC組（P<0.05）。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)顯示 TIMP-3誘導(dǎo)

5、兩肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡(SMMC-7721：30.7±1.6％vs8.4±1.1%，P=0.001；HepG2：12.6±1.1%vs7.6±1.3%，P=0.038）和產(chǎn)生G2/M期阻滯[SMMC-7721：（G0/G1期：(36.075±3.53)%vs(57.72±1.53)%， G2/M期：(51.91±1.71)%vs(30.11±0.20)%，P=0.030）；HepG2：（G0/G1期：(49.82±1.46)%vs(59.4

6、7±1.27)%，G2/M期：(26.27±0.54)%vs(14.15±3.6)%，P=0.034）]。
　　5.體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示TIMP-3使兩肝癌細(xì)胞的侵襲能力顯著降低（SMMC-7721：60±11 vs121±17，P=0.033；HepG2：98±6 vs192±22，P=0.015）；體外遷移實(shí)驗(yàn)顯示TIMP-3使兩肝癌細(xì)胞的遷移能力顯著降低（SMMC-7721：53±8 vs102±10，P=0.038；HepG2