沉默Id-1基因?qū)θ丝谇话┘?xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響.pdf

1、第一部分Id-1基因在口腔癌細(xì)胞中的表達(dá)
　　 目的：
　　 口腔癌是臨床較常見疾病,近年來發(fā)病率有增加趨勢,其發(fā)病年齡以40～60歲為發(fā)病高峰年齡段,但60～70歲年齡段發(fā)病率明顯增加,占總數(shù)17.8％,發(fā)病平均年齡54.1歲,表明口腔癌發(fā)病有老齡化趨向?？谇话┐蟛糠职l(fā)生于口腔(唇部除外),占總數(shù)78.4％,其他依次為大唾液腺、上頜竇、頸、咽、唇部。口腔中好發(fā)部位按序為舌、上下牙齦、頰、腭、上下頜骨、口底,舌癌已躍居首

2、位?？谇话┑牟±眍愋鸵憎[癌和腺樣囊性癌居多,這兩種類型惡性程度也比較大,容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,尤其是腺樣囊性癌,極容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,而且具有嗜神經(jīng)性。因此,我們選擇了最具代表性的鱗癌細(xì)胞系SAS、Tca8113、Buccl885和腺樣囊性癌的細(xì)胞系A(chǔ)CCM、ACC-2這五種典型的口腔癌細(xì)胞系進(jìn)行篩選。DNA結(jié)合抑制蛋白(Inhibitor of DNA binding,Id),屬于螺旋-環(huán)-螺旋蛋白質(zhì)超家族,相對分子質(zhì)量為13000～2000

3、0,它是一組缺乏堿性DNA連接結(jié)構(gòu)域的HLH因子。Id-1是人類迄今為止發(fā)現(xiàn)的4個Id蛋白家族成員(Id-1～4)中研究最多,也是最重要的一個。研究發(fā)現(xiàn):Id-1在上皮來源的腫瘤中呈高表達(dá),它通過抑制細(xì)胞分化、推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、抑制衰老、誘導(dǎo)侵襲、參與腫瘤性血管新生而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展；在大腸癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中都發(fā)揮著重要的作用。然而在口腔癌中,Id-1的表達(dá)量如何,其對于口腔癌

4、細(xì)胞的生長和侵襲能力的影響尚不得而知。本研究將檢測口腔癌這五種典型細(xì)胞系的Id-1表達(dá)情況。
　　 方法
　　 口腔鱗癌細(xì)胞系SAS、Tca8113、Buccl885和腺樣囊性癌的細(xì)胞系A(chǔ)CCM、ACC-2解凍復(fù)蘇,于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37℃、含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中密閉培養(yǎng)。取對數(shù)生長的細(xì)胞,用Trizol裂解液提取總RNA,將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后用Id-1引物進(jìn)行(Real-time fl

5、uorescence quantitative PCR,RFQ-PCR)擴增,擴增體中加入SYBR GreenⅠ,進(jìn)行RFQ-PCR實驗,檢測五種細(xì)胞系的Id-1基因的mRNA表達(dá)情況。再取對數(shù)生長的細(xì)胞,常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白,一抗和二抗孵育,進(jìn)行Western Blot實驗,檢測五種細(xì)胞系的Id-1基因的蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 實驗結(jié)果顯示,鱗癌細(xì)胞系SAS、Tca8113、Buccl885和腺樣囊性癌的

6、細(xì)胞系A(chǔ)CCM、ACC-2五種細(xì)胞系Id-1均呈現(xiàn)高表達(dá),其中,腺癌細(xì)胞系Id-1表達(dá)量最高的是ACCM,鱗癌細(xì)胞系Id-1表達(dá)量最高的是SAS。RFQ-PCR結(jié)果顯示:腺癌細(xì)胞系Id-1mRNA表達(dá)量最高的是ACCM(P<0.05),鱗癌細(xì)胞系Id-1mRNA表達(dá)量最高的是SAS(P<0.05)。Western Blot結(jié)果顯示:其中,腺癌細(xì)胞系Id-1表達(dá)量最高的是ACCM(P<0.05),鱗癌細(xì)胞系Id-1表達(dá)量最高的是SAS(P

7、<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 實驗結(jié)果提示,鱗癌細(xì)胞系SAS、Tca8113、Buccl885和腺樣囊性癌的細(xì)胞系A(chǔ)CCM、ACC-2五種細(xì)胞系Id-1mRNA和Id-1蛋白均呈現(xiàn)高表達(dá),其中,腺癌細(xì)胞系Id-1表達(dá)量最高的是ACCM,鱗癌細(xì)胞系Id-1表達(dá)量最高的是SAS。我們篩選出了腺癌細(xì)胞系Id-1表達(dá)量最高的ACCM和鱗癌細(xì)胞系Id-1表達(dá)量最高的SAS兩個細(xì)胞系。
　　 第二部分
　　 沉

8、默Id-1基因?qū)ο贅幽倚园┘?xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響
　　 目的：
　　 腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC),是發(fā)生于頭頸部涎腺最常見的惡性腫瘤,約占所有惡性腫瘤20％,具有高度的侵襲和轉(zhuǎn)移特性。由于對ACC生物學(xué)性質(zhì)認(rèn)識上的局限性,目前尚無很有效的治療措施,即使進(jìn)行了廣泛的手術(shù)切除及放射治療,大多數(shù)患者最終出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。臨床上急待尋求治療ACC的新方法。
　　 Id蛋白屬于

9、螺旋-環(huán)-螺旋蛋白質(zhì)超家族,相對分子質(zhì)量為13000～20000,它是一組缺乏堿性DNA連接結(jié)構(gòu)域的HLH因子。bHLH蛋白二聚體的形成是DNA與“E盒”(CANNTG)或“N盒”(CACNAG)識別序列結(jié)合的必要條件,Id蛋白通過與bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成異型二聚體,干擾其與DNA的結(jié)合,阻斷其對下游分子的轉(zhuǎn)錄激活作用,抑制基因的表達(dá),從而抑制細(xì)胞的正常分化,促進(jìn)細(xì)胞增殖。Id-1是人類迄今為止發(fā)現(xiàn)的4個Id蛋白家族成員(Id-1～4)中

10、研究最多,也是最重要的一個。研究發(fā)現(xiàn):Id-1在上皮來源的腫瘤中呈高表達(dá),它通過抑制細(xì)胞分化、推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、抑制衰老、誘導(dǎo)侵襲、參與腫瘤性血管新生而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展；在大腸癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中都發(fā)揮著重要的作用。然而在ACC中,Id-1的表達(dá)量如何,其對于ACC的生長和侵襲能力的影響尚有待于研究證實。
　　 以往研究發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)的Id-1信號通路有很多,有Akt-

11、mediated Wnt信號通路,p53 and NF-κB信號通,PI3K/Akt/NFκB信號通路,ERK/MAPK信號通路等等。我們前期研究發(fā)現(xiàn),正常涎腺組織中Id-1的表達(dá)量非常低(甚至難以檢測到),但是在涎腺腺樣囊性癌中卻呈現(xiàn)高表達(dá),這說明Id-1表達(dá)水平的升高可能打破了正常細(xì)胞內(nèi)癌基因與抑癌基因相互制約的平衡關(guān)系,進(jìn)而激活某條或多條信號傳導(dǎo)通路推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞增殖,從而誘導(dǎo)正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化,增加

12、通過淋巴管道和血道向周圍淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官侵襲和轉(zhuǎn)移的機會。
　　 我們選用設(shè)計好的Id-1siRNA序列,應(yīng)用lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,沉默掉ACCM細(xì)胞系的Id-1基因,然后檢測ACCM細(xì)胞系增殖、侵襲和凋亡的改變及ki67、c-myc和p21蛋白含量變化。
　　 方法
　　 于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37℃、含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中密閉培養(yǎng)腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)CCM。用設(shè)計好

13、的Id-1siRNA序列,應(yīng)用lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,沉默ACCM細(xì)胞系的Id-1基因。RFQ-PCR、Westernblot檢測、免疫熒光確認(rèn)干擾成功。MTT比色法于570 nm處測定光密度值(OD),描記干擾前后細(xì)胞的生長曲線。Transwell小室檢測干擾前后細(xì)胞侵襲性能的改變。流式細(xì)胞儀檢測干擾前后細(xì)胞的凋亡情況。Western blot檢測ki67、c-myc和p21蛋白含量變化。
　　 結(jié)果：

14、r>　　 實驗結(jié)果顯示RFQ-PCR、Western blot檢測、免疫熒光確認(rèn)干擾成功。MTT比色法描記的干擾前后細(xì)胞的生長曲線結(jié)果顯示:Id-1siRNA干擾后ACCM增殖能力下降,與未干擾對照組有顯著差異(0.5806±0.0063vs0.7469±0.0424,P<0.01；0.6378±0.0040vs1.0110±0.0010,P<0.01；0.7679±0.0036vs1.2774±0.0036,P<0.01)。Tran

15、swell小室檢測的結(jié)果顯示:Id-1siRNA干擾后ACCM侵襲能力下降,與未干擾對照組有顯著差異((10.6667±2.0656)vs(29.8333±1.7224),P<0.01)。流式細(xì)胞儀檢測的凋亡結(jié)果顯示:Id-1siRNA干擾后ACCM凋亡增多,與未干擾對照組有顯著差異((23.2767±1.2872)％vs(2.2467±0.0924)％,P<0.01)。Western blot檢測ki67、c-myc和p21蛋白含量變

16、化顯示:Id-1siRNA干擾后ACCM中ki67含量減少、c-myc含量減少和p21含量增加,與未干擾對照組有顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 結(jié)果：提示通過RNA干擾沉默Id-1基因后,ACCM生長受到抑制、侵襲能力均受到抑制,細(xì)胞凋亡增多；ACCM中ki67含量減少、c-myc含量減少和p21含量增加。其機制可能是通過沉默Id-1基因,腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CCM本來呈現(xiàn)高表達(dá)的Id-1出現(xiàn)低表達(dá)或者無表達(dá),本來被打破了