siRNA沉默uPAR和Cathepsin B基因表達對肝癌細胞增殖、侵襲、凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　探討siRNA單獨或聯(lián)合沉默uPAR和Cathepsin B基因?qū)Ω伟┘毎鲋场⑶忠u、凋亡的影響。
　　方法:
　　用帶熒光的siRNA轉(zhuǎn)染人類肝癌細胞(SMMC-7721)，篩選合適的siRNA轉(zhuǎn)染濃度，以該濃度進行實驗。分別人工構(gòu)建并合成靶向沉默uPAR和Cathepsin B基因的三條siRNA和一條陰性siRNA。轉(zhuǎn)染人類肝癌細胞SMMC-7721后，實時熒光定量PCR技術(shù)和WB技術(shù)分別檢測基因水平

2、上和蛋白水平上沉默uPAR和Cathepsin B基因最好的siRNA，篩選出的兩個siRNA用于后續(xù)實驗。單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)染后，熒光定量PCR技術(shù)和WB技術(shù)分別檢測uPAR和Cathepsin B的基因表達水平和蛋白表達水平。MTT實驗檢測單獨或聯(lián)合沉默uPAR和Cathepsin B基因后癌細胞的增殖情況?；|(zhì)膠侵襲實驗檢測細胞侵襲能力的改變。流式細胞技術(shù)檢測肝癌細胞凋亡率的變化。
　　結(jié)果:
　　1.按Roch說明書，從不

3、同比例的轉(zhuǎn)染試劑和siRNA中篩選出轉(zhuǎn)染最佳濃度，我們發(fā)現(xiàn)低濃度siRNA進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染率達80％，細胞狀態(tài)最好。
　　2.按低濃度siRNA進行轉(zhuǎn)染，實時熒光定量PCR法分別檢測各組肝癌細胞SMMC-7721的uPAR和Cathepsin B基因水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48h后，與空白對照組(no-treatment control，NTC)相比，三個siRNA組的uPAR和Cathepsin B基因mRNA的相對表達量均受到明顯抑

4、制(P＜0.05)。由數(shù)據(jù)看出，在基因水平上，si-uPAR-C沉默uPAR基因效果最好，si-CTSB-B沉默Cathepsin B基因效果最好。
　　3.轉(zhuǎn)染后72h，WB法分別檢測各組uPAR和Cathepsin B的蛋白水平。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，三個siRNA組的uPAR和Cathepsin B蛋白的相對表達量受到明顯抑制(P＜0.05)。由數(shù)據(jù)看出，從蛋白水平上來說，si-uPAR-C沉默uPAR的效果最好，si

5、-CTSB-B沉默Cathepsin B的效果最好。綜合基因和蛋白檢測的結(jié)果，uPAR基因選擇si-uPAR-C片段，Cathepsin B基因選擇si-CTSB-B片段進行后續(xù)實驗。
　　4.單獨或聯(lián)合沉默實驗共設(shè)五組(NTC、LC、si-uPAR、si-CTSB、si-UC)，實時熒光定量PCR分別檢測單獨或聯(lián)合沉默后uPAR和Cathepsin B的基因水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48h后，與NTC組相比，uPAR基因在si-uPA

6、R和si-UC表達受到明顯抑制，CTSB基因在si-CTSB和si-UC表達受到明顯抑制，而且聯(lián)合沉默組比單獨沉默抑制效果更明顯(P＜0.05)。
　　5.WB檢測轉(zhuǎn)染72h后，各組SMMC-7721細胞uPAR和Cathepsin B的蛋白水平。結(jié)果顯示，與NTC組相比，uPAR蛋白在si-uPAR和si-UC組表達受到明顯抑制，Cathespin B在si-CTSB和si-UC表達受到明顯抑制，聯(lián)合沉默組均比單獨沉默組抑制效果

7、更明顯(P＜0.05)。
　　6.MTT實驗檢測聯(lián)合沉默后0h、24h、48h、72h細胞增殖情況。轉(zhuǎn)染24h后，si-CTSB組、si-UC組與NTC組相比細胞增殖明顯較少(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染48h后，si-uPAR組與NTC組相比細胞增殖明顯減少（P＜0.05），而且轉(zhuǎn)染48h后，聯(lián)合沉默組比單獨沉默組細胞增殖抑制更明顯(P＜0.05)。NTC組與LC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　7.侵襲實驗顯示，轉(zhuǎn)染后后

8、48h，與空白對照組間比較，各siRNA組侵襲的細胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)，聯(lián)合沉默組比單獨沉默組減少更明顯（P＜0.05）
　　8.流式細胞技術(shù)檢測細胞調(diào)亡，轉(zhuǎn)染后48h，單獨或聯(lián)合沉默組中凋亡細胞比NTC組明顯增多(P＜0.05)，聯(lián)合沉默組凋亡細胞較單獨沉默組明顯增多(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　siRNA靶向沉默uPAR或Cathepsin B基因能有效減少該基因的表達。單獨沉默或聯(lián)合沉默uPAR或C