ASAP3對(duì)人肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國(guó)最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是成功治療HCC的最大障礙，也是造成癌癥患者死亡的主要原因。目前肝細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制還不很清楚，因此探索腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制、尋找抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的有效靶點(diǎn)，一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。ASAP3（ARF-GAP containing SH3，ANK repeats and PH dommn3），又名UPLCl、ACAP4、

2、DDEFLl，是ARF(ADP ribosylation factor)-GAPs(GTPase Activiting Protein)家族的一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的成員。與該家族的大部分成員一樣，該蛋白具有BAR、PH、GAP和ANK等多個(gè)結(jié)構(gòu)域，可能在細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞骨架組裝、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞遷移等方面發(fā)揮著重要的作用。研究表明，ASAP3在人肝細(xì)胞癌中超量表達(dá)。本課題通過(guò)ASAP3特異性siRNA和ASAP3真核表達(dá)載體分別在高轉(zhuǎn)移性和低轉(zhuǎn)

3、移性的HCC細(xì)胞株（MHCC97H和Hep3B）中抑制和增強(qiáng)ASAP3的表達(dá)，探討ASAP3基因表達(dá)與HCC腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，旨在為其臨床應(yīng)用研究提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為以此為靶點(diǎn)進(jìn)行HCC防治研究提供新策略。
　　目的：構(gòu)建ASAP3-siRNA表達(dá)載體和ASAP3真核表達(dá)載體并將之轉(zhuǎn)染入侵襲轉(zhuǎn)移潛力不同的肝癌細(xì)胞中以獲得ASAP3基因“沉默”和“增強(qiáng)”的HCC細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上，揭示ASAP3與肝癌細(xì)胞

4、侵襲轉(zhuǎn)移潛能之間的關(guān)系，為肝癌的基因治療提供新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)資料。
　　方法：（1）利用生物信息學(xué)技術(shù)在線(xiàn)設(shè)計(jì)特異性ASAP3和GAPDH-siRNA，在體外構(gòu)建和克隆ASAP3和GAPDH-siRNA表達(dá)載體（pASAP3-siRNA和pGAPDH-siRNA）；（2）將ASAP3-siRNA表達(dá)載體及pGAPDH-siRNA分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MHCC97H肝癌細(xì)胞中，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陰性對(duì)照；RT-PCR法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株MHCC97H

5、細(xì)胞ASAP3 mRNA表達(dá)水平，Western印跡法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株MHCC97H細(xì)胞ASAP3蛋白表達(dá)強(qiáng)度，鑒定ASAP3-siRNA表達(dá)載體的功能；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖和粘附率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲性；（3）構(gòu)建和克隆ASAP3真核表達(dá)載體（pASAP3）；（4）將pASAP3真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hep3B肝癌細(xì)胞中；RT-PCR法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株Hep3B細(xì)胞ASA

6、P3 mRNA表達(dá)水平，Western-Blot法檢測(cè)Hep3B細(xì)胞中ASAP3蛋白的表達(dá)水平，鑒定pASAP3真核表達(dá)載體的功能；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖和粘附率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲性。
　　主要結(jié)果：（1）構(gòu)建的pASAP3-siRNA表達(dá)載體對(duì)MHCC97H表達(dá)ASAP3 mRNA的沉默效率約為67％，對(duì)ASAP3蛋白表達(dá)的抑制率也超過(guò)65％，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制

7、率為42.03±4.36％。（2）pASAP3-siRNA轉(zhuǎn)染MHCC97H細(xì)胞48h后，凋亡率為13.88±1.74％，而在其他對(duì)照組中并無(wú)明顯凋亡出現(xiàn)；細(xì)胞接種60min后，pASAP3-siRNA轉(zhuǎn)染MHCC97H細(xì)胞的粘附率明顯降低，為26.89±6.39％，和其他對(duì)照組比較具有顯著性差異（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染24h后，ASAP3-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的劃痕愈合較慢(37.67±10.04％)，pASAP3-siRNA轉(zhuǎn)染MHCC

8、97H細(xì)胞的侵襲力下降，較前兩組明顯降低(P＜0.01)。（3）pASAP3真核表達(dá)載體對(duì)Hep3B表達(dá)ASAP3 mRNA的增加效率約為3倍，對(duì)ASAP3蛋白表達(dá)的增加率也接近2倍。（4）pASAP3轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞48h后，對(duì)細(xì)胞增殖的增加率為31.23±10.14％；細(xì)胞接種60min后，pASAP3轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞的粘附率明顯提高，為42.75±9.36％，和其他對(duì)照組比較具有顯著性差異（P＜0.01）；轉(zhuǎn)染24h后，pAS

9、AP3轉(zhuǎn)染細(xì)胞的創(chuàng)口愈合較快(16.37±5.28％)和其他對(duì)照組比較具有顯著性差異（P＜0.05）；pASAP3轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞的侵襲力增強(qiáng)，較對(duì)照組明顯增高(P＜0.01)。
　　結(jié)論：（1）ASAP3-siRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MHCC97H細(xì)胞中可有效降低ASAP3的mRNA和蛋白的表達(dá)水平；ASAP3-siRNA對(duì)MHCC97H細(xì)胞的增殖能力有抑制作用；可誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞凋亡；還可明顯抑制其在細(xì)胞外基質(zhì)上的粘附率

10、、向劃痕損傷區(qū)的遷移能力和體外侵襲能力；（2）ASAP3真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞中可有效增加ASAP3的mRNA和蛋白的表達(dá)水平；pASAP3增強(qiáng)Hep3B細(xì)胞的增殖能力；還可明顯增強(qiáng)其在細(xì)胞外基質(zhì)上的粘附率、向劃痕損傷區(qū)的遷移能力和體外侵襲能力。本研究揭示，ASAP3可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移潛能。后續(xù)工作擬在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究ASAP3對(duì)HCC細(xì)胞作用的分子機(jī)制，找尋以ASAP3作為基因干預(yù)的靶點(diǎn)，對(duì)發(fā)現(xiàn)肝癌治療新策略、防止肝癌