ARHI基因?qū)σ认侔┘毎w外增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其相關(guān)機制研究.pdf

1、在西方國家，胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，其死亡率占惡性腫瘤的第4位，在我國胰腺癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第5～7位。研究報道其1年存活率低于20％，5年存活率僅為3％。胰腺癌的發(fā)病率與死亡率十分接近，預后非常差。因此應加強胰腺癌基因和分子水平的研究，期望從中發(fā)現(xiàn)胰腺癌診斷與治療的有益線索，提高胰腺癌的診治水平。
　　 現(xiàn)有資料表明，胰腺癌的發(fā)生是多基因參與、多階段累積漸進的復雜過程。癌基因激活和抑癌基因失活是腫瘤發(fā)生最基本的分子

2、事件，這會導致細胞生長失控而發(fā)生癌變。在細胞癌變過程中，經(jīng)常出現(xiàn)一個或多個抑癌基因的缺失，表明抑癌基因的失活參與了胰腺癌的發(fā)生。ARHI是母源性印跡的抑癌基因，屬于RaS超家族中的一員，但與Ras不同，具有抑癌作用。ARHI基因最早發(fā)現(xiàn)于婦科腫瘤，研究也最多，是與乳腺癌及卵巢癌相關(guān)的抑癌基因。由于在正常胰腺表達僅次于卵巢，我們實驗室自2000年開始對ARHI在胰腺癌中的作用進行了研究。前期研究結(jié)果表明ARHI基因在正常胰腺組織廣泛表達，

3、在胰腺癌組織(47.8％)和細胞(8/8)中表達下調(diào)或缺失。將ARHI基因轉(zhuǎn)染導入該基因表達缺失的胰腺癌細胞，可以誘導胰腺癌細胞凋亡，其作用可抑制RAS/MAPK信號通路，降低STAT3的活性。我們提出：ARHI基因可能是胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的候選抑癌基因的假設。為了進一步證實我們的假設，并且為深入了解ARHI基因在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，本研究將在上述研究基礎之上，對ARHI進行了較系統(tǒng)研究。
　　 本研究目的是：首次通過

4、建立.ARHI基因和空載體穩(wěn)定表達的胰腺癌細胞株，觀察了ARHI基因?qū)σ认侔┘毎鲋澈偷蛲龅挠绊?；研究了ARHI基因轉(zhuǎn)染對胰腺癌細胞周期調(diào)控的影響，并首先詳細探索了影響胰腺癌細胞周期的作用機制；第一次初探了ARHI基因轉(zhuǎn)染后對胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)機制。確證ARHI基因?qū)σ认侔盒员硇偷牟糠忠种乒δ?，進一步驗證ARHI基因為胰腺癌的抑癌基因。
　　 本研究論文在上述研究基礎上，從增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移三個方面研究了A

5、RHI基因在胰腺癌細胞中的作用。
　　 第一部分：ARHI在胰腺癌中的抑癌作用及其對PI3K/AKT信號通路的影響
　　 以ARHI基因穩(wěn)定表達的PANC—1、MiaPaCa—2細胞株進行以下研究：
　　 方法：1)應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和G418篩選的方法建立了ARHI基因穩(wěn)定表達的PANC—1、MiaPaCa—2細胞株，并通過RT—PCR和Western blot方法驗證ARHI在穩(wěn)定細胞株中基因和蛋白表達。2)通過

6、生長曲線和MTT方法分析ARHI基因?qū)σ认侔┘毎鲋车挠绊憽?)流式細胞儀PI染色檢測ARHI基因?qū)σ认侔┘毎蛲鲇绊憽?)采用Western blot方法檢測了ARHI基因?qū)I3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路和死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK1)的影響。
　　 研究結(jié)果顯示：1)ARHI基因穩(wěn)定表達的PANC—1、MiaPaCa—2細胞株有ARHI蛋白和mRNA的表達，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組無ARHI mRNA和蛋白表達。2)在ARHI組，細胞

7、生長速度要比空載體組明顯減慢，ARHI抑制了胰腺癌細胞的生長，在3～5天，與空載體組比較，具有明顯的差異性(P*＜0.05和P**＜0.01)，尤其在第5天時，抑制作用最強，對PANC—1細胞而言，空載體組細胞數(shù)增長了8.5倍， ARHI組只增長了2.8倍。同樣，從MiaPaCa—2細胞的生長曲線數(shù)據(jù)分析，ARHI同樣可以明顯的抑制細胞的生長。3)在ARHI組，PANC—1、MiaPaCa—2凋亡細胞的百分率分別為32.9％和39.5％

8、，對應空載體細胞分別為13.8％和15.2％，與空載體組比較，ARHI明顯增加細胞凋亡百分率(P＜0.05)。4)在ARHI組，DAPK1 mRNA和蛋白表達均比空載體和無轉(zhuǎn)染組明顯上調(diào)。5)與空載體比較，ARHI蛋白表達后顯著下調(diào)PI3K/AKT信號通路中p—AKT蛋白的表達。
　　 小結(jié)：通過建立ARHI基因穩(wěn)定表達的PANC—1、MiaPaCa—2細胞株，發(fā)現(xiàn)：1)ARHI抑制胰腺癌細胞的生長。2)ARHI誘導胰腺癌細胞發(fā)

9、生凋亡。3)ARHI基因可能通過影響胰腺癌細胞DAPK1蛋白，改變了胰腺癌細胞的凋亡機制。4)降低p—AKT蛋白的表達，下調(diào)與腫瘤發(fā)生相關(guān)的PI3K/AKT信號傳導通路。5)前期的工作和本實驗表明ARHI基因在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中是一個抑癌基因。
　　 第二部分：抑癌基因ARHI對胰腺癌細胞周期停滯作用機制的研究
　　 方法：1)流式細胞儀PI染色方法檢測ARHI基因和空載體對胰腺癌細胞株細胞周期的影響。2)通過West

10、ern blot檢測了p—AKT、AKT和MDM2蛋白的表達。3)通過Western blot技術(shù)檢測了與細胞周期負調(diào)控相關(guān)的蛋白表達(包括p53、p21WAF1、p27KIP1)和正調(diào)控相關(guān)的蛋白表達(包括cyclinA—Cdk2，cyclinE—Cdk2和cyclinD1—Cdk4)。4)應用PI3K/AKT的抑制劑LY294002干預ARHI表達的細胞株，檢測了上述蛋白的表達。
　　 研究結(jié)果顯示：1)ARHI基因可顯著影

11、響胰腺癌細胞株的細胞周期，表現(xiàn)為G1期的增加和S期的減少，PANC—1細胞G1期百分數(shù)由空載體的56％上升到ARHI組的75％，MiCra—2細胞由54％上升到67％，ARHI組和空載體組比較，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。2)與轉(zhuǎn)染空載體相比，轉(zhuǎn)染ARHI基因的細胞，在p—AKT、MDM2蛋白下調(diào)的同時，p53、p21WAF1蛋白的表達明顯上調(diào)。應用LY294002處理ARHI轉(zhuǎn)染的細胞后，p53，p21WAF1蛋白上調(diào)，而ARHI蛋

12、白的表達沒有變化。3)ARHI表達的細胞株中，p27KiP1蛋白表達要比空載體和對照組明顯上調(diào)，同時應用PI3K/AKT的抑制劑LY294002也可以導致p27Kip1蛋白表達上調(diào)。4)與空載體組相比，在ARHI轉(zhuǎn)染的細胞中cyclinA，D1和Cdk2，4的蛋白表達下調(diào)，cyclin E水平無變化。應用PI3K/AKT的抑制劑LY294002處理ARHI表達的PANC—1細胞12小時后，cyclinA，D1和Cdk2，4蛋白水平?jīng)]有變

13、化。
　　 小結(jié)：轉(zhuǎn)染ARHI基因后，細胞周期停滯在G1期，一方面是ARHI抑制了PI3K/AKT/MDM2信號通路，誘導p53和CDK抑制因子CKIs p21wAF1和p27Kip1表達上調(diào)，負向調(diào)控CDKs的活性引起的，另一方面幾種細胞周期正調(diào)控蛋白cyclinA，D1和Cdk2，4的表達下調(diào)也參與了G1期的停滯。
　　 第三部分：ARHI基因?qū)σ认侔┘毎w外侵襲轉(zhuǎn)移作用的初步探索
　　 方法：1)應用細胞劃

14、痕和Transwell小室遷移方法研究了ARHI基因?qū)σ认侔┘毎w移的影響。2)通過Transwell小室侵襲實驗觀察了ARHI基因?qū)σ认侔┘毎忠u的影響。3)采用Pull—Down實驗研究了ARHI基因?qū)as和RhoA活性的改變。
　　 研究結(jié)果顯示：1)細胞劃痕實驗結(jié)果表明，在ARHI組，細胞遷移速率比空載體組減慢，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。2)在12h時，PANC—1和MiaPaCa—2細胞在ARHI組的遷移率分別為

15、(13.23±3.44)％和(14.02±2.08)％，Vector組對應的遷移率分別為(19.54±3.19)％和(21.50±2.41)％，兩組統(tǒng)計學差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。3)表達ARHI基因的PANC—1和MiaPaCa—2細胞的侵襲率分別為(8.47±1.74)％和(7.78±0.70)％，在相同時間內(nèi)明顯低于空載體侵襲率(分別為(11.58士1.76)％和(10.43～1.14)％)，統(tǒng)計學差異顯著(P＜0.

16、05或P＜0.01)。4)轉(zhuǎn)入ARHI基因后，Ras—GTP活性降低，RhoA.GTP活性沒有改變。
　　 小結(jié)：1)ARHI基因可以抑制胰腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。2)ARHI基因降低了Ras.GTP活性。3)ARHI發(fā)揮抑制細胞侵襲遷移的作用可能與Ras—RhoA無關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1)ARHI抑制胰腺癌細胞的增殖和誘導凋亡。
　　 2)ARHI基因使細胞周期停滯在G1期，一方面是ARHI抑制了P

17、13K/AKT/MDM2信號通路，誘導p53和CDK抑制因子CKIs p21wAF’和p27bP’表達上調(diào)，負向調(diào)控CDKs的活性引起的，另一方面幾種細胞周期正調(diào)控蛋白cyclin A，D1和Cdk2，4的表達下調(diào)也參與了G1期的停滯。
　　 3)ARHI基因可以抑制胰腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。該抑制作用可能與Ras—RhoA通路無關(guān)。
　　 4)ARHI基因可以部分抑制胰腺癌細胞惡性表型，進一步驗證了ARHI為胰腺癌的抑癌基