ARK5在肝癌組織中的表達(dá)及對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響.pdf

1、肝細(xì)胞癌（HCC）為世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，有研究報道HBV和HCV感染為HCC最主要的病因，在歐美等其他一些發(fā)達(dá)國家或地區(qū)，酒精性肝硬化以及與肥胖相關(guān)的非酒精性脂肪肝亦是造成罹患HCC的主要原因。惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展通常是由體內(nèi)外多種因素共同作用的多階段參與的復(fù)雜過程。HCC的發(fā)生過程是由體內(nèi)外多種因素以及多條信號通路共同作用的結(jié)果，盡管目前臨床已廣泛使用常規(guī)放療以及化療等技術(shù)有效控制了HCC的發(fā)生和發(fā)展，但大部分患者在接受上

2、述療法之后的預(yù)后情況依然不容樂觀。靶向治療是目前新發(fā)現(xiàn)的、能夠有效治療HCC的新途徑，已成為基礎(chǔ)腫瘤醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)內(nèi)容。廣大的醫(yī)學(xué)工作者們正在試圖尋找能夠成為臨床上有效治療HCC的新靶點(diǎn)，以期為有效控制HCC和改善患者預(yù)后奠定基礎(chǔ)。ARK5的異常表達(dá)與臨床上多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展存在密切聯(lián)系，還與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。目前研究已證實(shí)ARK5基因在人類的多種惡性腫瘤組織中存在高表達(dá)，特別是在一些侵襲和轉(zhuǎn)移性較高的惡性腫瘤中，

3、但其在HCC中表達(dá)研究相對較少。目前對于Akt(Protein Kinase B)在HCC發(fā)生和發(fā)展過程中如何調(diào)控ARK5與HCC腫瘤的增殖、凋亡以及侵襲過程中的相關(guān)機(jī)制的研究依然較少，TGF-β1(transforming growth factor-beta1)信號通路出現(xiàn)異常是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移等過程的重要因素，TGF-β1信號通路出現(xiàn)異常是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移等過程的重要因素。本研究擬觀察ARK5在HCC患

4、者腫瘤組織中的表達(dá)及意義，分析ARK5表達(dá)的變化對HCC腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響，探究TGF-β1和Akt信號活化對HCC腫瘤細(xì)胞中ARK5表達(dá)的調(diào)控作用及其對HCC腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，旨在為了解HCC的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制并為HCC的臨床診斷及靶向治療提供可靠依據(jù)。
　　目的：觀察ARK5在肝細(xì)胞癌（HCC）患者腫瘤組織中的表達(dá)及意義，分析ARK5表達(dá)的變化對HCC腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響，探究TGF-β1和Akt信

5、號活化對HCC腫瘤細(xì)胞中ARK5表達(dá)的調(diào)控作用及其對HCC腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，旨在為了解HCC的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制并為HCC的臨床診斷及靶向治療提供可靠依據(jù)。
　　方法：⑴運(yùn)用熒光定量PCR對20例HCC組織以及相應(yīng)癌旁正常組織樣品中ARK5 mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行測定；運(yùn)用western blot法檢測HCC癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織中 ARK5蛋白的表達(dá)；運(yùn)用免疫組織化學(xué)法檢測樣品中 ARK5蛋白的表達(dá)；分析ARK5蛋白的表

6、達(dá)與HCC患者臨床病理參數(shù)以及患者生存率的相關(guān)性。⑵將siRNA-ARK5轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞AMMC-7721，以此降低細(xì)胞中ARK5的表達(dá)；熒光定量PCR和western blot法檢測轉(zhuǎn)染后AMMC-7721細(xì)胞中ARK5 mRNA和相應(yīng)蛋白的表達(dá)；運(yùn)用MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖活性；Annexin V-FITC/PI雙染法檢測轉(zhuǎn)染對細(xì)胞凋亡的影響；用Transwe II小室法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的侵襲能力；細(xì)胞劃痕實(shí)驗檢測轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞遷移

7、能力的影響；檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Caspase-3活性。⑶將TGF-β1抑制劑Ly364947作用于人肝癌細(xì)胞AMMC-7721，以此降低細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)，BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗檢測細(xì)胞的增殖能力；用Transwe II小室法檢測細(xì)胞的侵襲能力；細(xì)胞劃痕實(shí)驗檢測細(xì)胞的遷移能力；western blot法檢測細(xì)胞中TGF-β1、Akt、ARK5蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：①ARK5 mRNA及其相應(yīng)蛋白在HCC癌組織中的表達(dá)顯著高于其

8、在相應(yīng)癌旁正常肝臟組織中的表達(dá)；ARK5高表達(dá)與HCC腫瘤大小、組織分化程度、腫瘤分期顯著相關(guān)（P<0.05）；而與患者年齡、肝硬化、HBsAg、血清AFP無關(guān)（P>0.05）；ARK5蛋白表達(dá)能夠作為HCC的一個獨(dú)立預(yù)后判斷因素。②轉(zhuǎn)染siRNA-ARK5后AMMC-7721細(xì)胞中ARK5 mRNA和相應(yīng)蛋白的表達(dá)顯著降低（P<0.05）；siRNA-ARK5組AMMC-7721細(xì)胞的增殖活性顯著低于siRNA-NC組和空白組，且si

9、RNA-ARK5組細(xì)胞生長抑制率在48 h為最高，與siRNA-NC組相比差異顯著（P<0.01）；轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA-ARK5組細(xì)胞的凋亡率明顯增高，與空白組相比差異顯著（P<0.01）；siRNA-ARK5組細(xì)胞的侵襲能力明顯降低，與與空白組相比差異顯著（P<0.05）；與空白組相比，siRNA-ARK5組細(xì)胞的遷移能力明顯降低（P<0.01）；siRNA-ARK5組細(xì)胞的caspase-3活性較空白組明顯增高。③TGF-β

10、1抑制劑Ly364947作用于AMMC-7721細(xì)胞后，TGF-β1 inhibitor組細(xì)胞的增殖活性較對照組明顯降低（P<0.01）；TGF-β1 inhibitor組細(xì)胞的侵襲能力較對照組明顯降低（P<0.05）；TGF-β1 inhibitor組細(xì)胞的遷移能力較對照組明顯降低（P<0.01）；TGF-β1被抑制后，細(xì)胞中的Akt和ARK5蛋白表達(dá)量較對照組顯著下降。
　　結(jié)論：HCC組織中ARK5的表達(dá)與腫瘤大小、組織分化