兩種BH3擬似物增強5-FU對人大腸癌細胞敏感性作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　大腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界第三常見惡性腫瘤。5-FU是治療大腸癌的重要化療藥物之一。雖然以5-FU為基礎(chǔ)的化療方案已經(jīng)成為治療大腸癌的重要途徑，然而由于固有和獲得性耐藥問題導致僅有約25％的患者對5-FU治療有效。雖然合用如奧沙利鉑等藥物能夠增強5-FU的臨床療效，但這些療法往往伴隨著明顯的不良反應并有約一半患者死亡。因此目前仍然迫切需要發(fā)展新的治療策略以增強5-FU抗腫瘤效果。

2、　　BH3擬似物(BH3-mimetics)是以Bcl-2家族抗凋亡蛋白為靶點的小分子化合物。BH3擬似物通過破壞Bcl-2家族抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白間的由BH3結(jié)構(gòu)域介導的相互作用誘導細胞凋亡。近年來，棉酚、apogossypol、ABT-737、ABT-263、TW-37、obatoclax、HA14-1等BH3擬似物已成為研究的熱點。多項試驗表明BH3擬似物能夠通過恢復高水平表達Bcl-2家族抗凋亡蛋白的腫瘤細胞正常凋亡途徑增強傳

3、統(tǒng)化療敏感性。如棉酚可以提高紫杉醇對人類前列腺癌PC-3細胞的細胞毒作用。醋酸棉酚和地塞米松合用可明顯增強后者促凋亡活性。棉酚同吉西他濱合用可以逆轉(zhuǎn)高水平表達Bcl-2蛋白的細胞株對吉西他濱的耐藥。在患者接受環(huán)磷酰胺-阿霉素-長春新堿-潑尼松龍(CHOP)方案治療前給予棉酚可獲得比單獨應用CHOP方案或者棉酚更好的療效。此外，棉酚被證明可增強地塞米松對多發(fā)性骨髓瘤細胞、環(huán)磷酰胺和美羅華對B細胞淋巴瘤移植瘤的治療作用。這些研究表明，棉酚同

4、與其他藥物合用可以提高細胞毒效應，因此將棉酚同常見化療藥物合用于治療耐藥的腫瘤可能是一種新策略。BH3I-2'是一種人工合成的結(jié)構(gòu)與Bak BH3肽鏈相似的小分子BH3擬似物。多項研究表明BH3I-2'通過同Bcl-2、 Bcl-XL結(jié)合誘導細胞凋亡。BH3I-2'也可增強某些抗腫瘤藥物的敏感性。研究表明BH3I-2'可增加死亡受體5單克隆抗體TRA-8對乳腺癌細胞的治療作用。BH3I-2'能增強膠質(zhì)瘤細胞和前列腺癌細胞對TRAIL的敏

5、感性。BH3I-2還可增強阿霉素和蛋白酶體抑制劑硼替佐米對Bcl-2蛋白過表達甲狀腺腫瘤細胞的敏感性。
　　本實驗擬通過研究兩種BH3擬似物（棉酚、BH3I-2'）能否增加5-FU對大腸癌細胞的敏感性及探討相關(guān)機制為大腸癌治療提供新的策略和方法，同時進一步揭示BH3擬似物抗腫瘤作用的機理，為BH3擬似物用于腫瘤的治療提供更多的實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、采用MTT法測定5-FU、棉酚和BH3I-2'對細胞增殖抑制作

6、用。
　　2、采用流式細胞術(shù)(PI單染法)進行細胞周期解析及凋亡判定。
　　3、采用Lipofectamine2000試劑進行瞬時轉(zhuǎn)染。
　　4、采用Westemblot檢測PARP、caspase-3，8，9、cyclin A、 cyclin D1、cyclin E、mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、TS和TP蛋白的表達。
　　5、統(tǒng)計學處理:每次實驗重復3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組間差異采

7、用Student's t-test分析。P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1、MTT法測得棉酚作用于三種大腸癌細胞24小時和48小時的IC50值，HT-29細胞為44.22±1.02μmol/L和26.11±1.04μmol/L; HCT116細胞為24.92±1.08μmol/L和14.11±1.08μmol/L; RKO細胞為31.25±1.04μmol/L和21.83±1.05μmol/L;以不同濃度BH3I

8、-2'作用于HCT116細胞24小時和48小時，以MTT法測得IC50值分別為107.5±1.27μmol/L和65.16±1.07μmol/L。不同濃度棉酚作用于HT-29細胞、RKO細胞和HCT116細胞48小時后，流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示隨著濃度增加亞二倍體凋亡峰(sub-G1峰)逐漸明顯，細胞凋亡率逐漸增高，G0/G1期細胞比例逐漸增高。不同濃度棉酚作用于HT-29細胞、RKO細胞和HCT116細胞24小時后，westernblo

9、t法分析結(jié)果顯示隨著濃度增加凋亡相關(guān)蛋白PARP，caspase3，8，9裂解逐漸增多，細胞周期蛋白D1表達水平逐漸降低而細胞周期蛋白A和細胞周期蛋白E表達水平無明顯改變。不同濃度BH3I-2作用于HCT116細胞24小時后，以westernblot法檢測結(jié)果顯示隨著濃度增加凋亡相關(guān)蛋白PARP、caspase3，8活化裂解程度逐漸增高，細胞周期蛋白D1表達水平逐漸降低而細胞周期蛋白A和細胞周期蛋白E表達水平無明顯改變。
　　2、

10、分別以20μg/ml5-FU和20μmol/L棉酚作用于HT-29細胞，4μg/ml5-FU和10μmol/L棉酚在作用于HCT116細胞，2μg/ml5-FU和10μmol/L棉酚，4μg/ml5-FU和40μmol/L BH3I-2作用于HCT116細胞48小時，MTT法分析結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組細胞活力明顯低于各單藥組。流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組亞二倍體凋亡峰(sub-G1峰)及G0/G1期細胞比例明顯高于各單藥組。Westem

11、blot法分析結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組凋亡相關(guān)蛋白PARP、caspase3活化裂解程度明顯高于各單藥組。此外，聯(lián)合用藥組細胞周期蛋白D1表達水平逐漸降低而細胞周期蛋白A和細胞周期蛋白E表達水平無明顯改變。
　　3、Westemblot法分析結(jié)果顯示棉酚及BH3I-2'均以濃度依賴的方式下調(diào)大腸癌細胞TS蛋白表達水平。同時二者均能顯著逆轉(zhuǎn)5-FU誘導TS蛋白表達增多以及下調(diào)5-FU活性代謝產(chǎn)物氟尿嘧啶脫氧核苷(5-FdUMP)與TS、四

12、氫葉酸共同形成的三元絡合物水平。以瞬時轉(zhuǎn)染siRNA法沉默TS蛋白表達可以增強單藥5-FU或者聯(lián)合用藥組誘導HCT116細胞凋亡作用。單藥棉酚，BH3I-2'或者同5-FU聯(lián)合用藥均對TP蛋白表達無明顯作用。
　　4、Westernblot法分析結(jié)果顯示棉酚及BH3I-2'單獨應用或者同5-FU聯(lián)合應用均可下調(diào)HCT116細胞和RKO細胞mTOR和S6K1蛋白磷酸化水平。 mTOR經(jīng)典抑制劑雷帕霉素可顯著地下調(diào)HCT116細胞和R

13、KO細胞mTOR和S6K1蛋白磷酸化水平以及細胞周期蛋白D1和TS蛋白表達，而對TP蛋白、細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白E表達水平?jīng)]有明顯影響，此作用同棉酚及BH3I-2'作用相似。
　　結(jié)論：
　　1、棉酚、BH3I-2'均以時間和濃度依賴性方式抑制大腸癌細胞增殖。棉酚及BH3I-2'均可通過激活內(nèi)源性和外源性凋亡途徑誘導大腸癌細胞凋亡。棉酚及BH3I-2'均可通過下調(diào)細胞周期蛋白D1表達水平引起細胞周期阻滯。
　　2

14、、棉酚、BH3I-2'均可通過增強5-FU誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯作用增強5-FU對大腸癌細胞敏感性。
　　3、棉酚、BH3I-2'均可通過下調(diào)TS蛋白表達水平增強5-FU誘導大腸癌細胞凋亡作用。
　　4、棉酚、BH3I-2'無論是否同5-FU聯(lián)合用藥均不影響TP蛋白表達水平。
　　5、棉酚、BH3I-2'通過負性調(diào)控mTOR/S6K1通路下調(diào)TS蛋白和細胞周期蛋白D1表達作用。
　　6、棉酚、BH3I-2'通