腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞自噬調(diào)控對大腸癌放射敏感性的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究調(diào)控腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)的自噬狀態(tài)對共培養(yǎng)大腸癌細(xì)胞放射敏感性的影響并探討其可能機(jī)制，為大腸癌的放射增敏研究提供新的思路;通過觀察自噬調(diào)控預(yù)處理的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)與大腸癌細(xì)胞混合接種小鼠的成瘤情況及移植瘤的放射敏感性，初步探索通過調(diào)控CAFs自噬狀態(tài)提高腫瘤放射治療效果的可能性。
　　方法:（一）取新鮮直腸癌組織手術(shù)標(biāo)本，進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，反復(fù)傳代純化，獲取CAFs;取大腸癌患者正常大腸粘膜原代培養(yǎng)

2、獲取正常成纖維細(xì)胞(CNFs)，并將其與大腸癌CCL224細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)生成CAFs;對CNFs及兩種方法獲取的CAFs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并以α-SMA、vimentin及CK18、SDF-1單抗進(jìn)行熒光免疫檢測鑒定;（二）以MDC自噬囊泡染色法、LC3免疫熒光法比較CNFs與CAFs自噬狀態(tài);篩選自噬上調(diào)劑雷帕霉素與自噬抑制巴弗洛霉素的最佳作用時(shí)間與劑量，分別對CAFs進(jìn)行自噬調(diào)控，以MDC法、LC3免疫熒光法及自噬相關(guān)蛋白Wester

3、n blot法進(jìn)行自噬調(diào)控效果比較;設(shè)立對照組（CAFs+大腸癌細(xì)胞組）、自噬上調(diào)組（雷帕霉素預(yù)處理CAFs+大腸癌細(xì)胞組）及自噬下調(diào)組（巴弗洛霉素預(yù)處理CAFs+大腸癌細(xì)胞），觀察不同CAFs自噬狀態(tài)對大腸癌侵襲與遷移能力對影響;通過觀察0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy照射后大腸癌細(xì)胞克隆形成能力、細(xì)胞凋亡等方法觀察經(jīng)自噬調(diào)控的CAFs對共培養(yǎng)大腸癌細(xì)胞放射敏感性的影響;并通過對腫瘤細(xì)胞γH2AX焦點(diǎn)計(jì)數(shù)以及P53、Bcl-2、

4、Bax、caspase-3、NFkB等蛋白的檢測與CAFs培養(yǎng)液中乳酸含量的檢測，分析經(jīng)自噬調(diào)控CAFs影響大腸癌放射敏感性的可能機(jī)制;（三）利用雷帕霉素與巴弗洛霉素分別對CAFs進(jìn)行自噬上調(diào)與下調(diào)，按照3∶1的比例與HCT116及CCL224大腸癌細(xì)胞混合接種于BALB/c裸鼠，分腫瘤細(xì)胞單獨(dú)接種組、CAFs+腫瘤混合接種組、自噬上調(diào)CAFs+腫瘤混合接種組、自噬下調(diào)CAFs+腫瘤混合接種組，每組含HCT116及CCL224亞組，每亞

5、組6只小鼠。觀察各種成瘤率、成瘤時(shí)間，瘤體體積變化與小鼠體重改變，并對成瘤小鼠進(jìn)行局部外照射，比較各組受照后小鼠體重與瘤體體積變化及照后7d瘤體重量，并通過HE染色、免疫組化及Western blot等方法觀察照后病理改變及相關(guān)蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:（一）利用直腸癌組織直接原代培養(yǎng)法或大腸粘膜原代培養(yǎng)獲取CNFs與腸癌細(xì)胞HCT116及CCL224共培養(yǎng)誘導(dǎo)法，均可可獲得α-SMA(+) SDF-1(+)vimentin(+)

6、CK18(-)的具有典型CAFs特征的肌成纖維細(xì)胞;（二）活化的CAFs細(xì)胞比CNFs具有更高的自噬水平;400nM雷帕霉素可進(jìn)一步增加CAFs自噬，Western blot檢測顯示DRAM、Atg5及Beclin-1、LC3等自噬相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，而400nM巴弗洛霉素可抑制CAFs自噬水平，DRAM、Atg5與Beclin-1基因表達(dá)下調(diào);不同CAFs自噬狀態(tài)對大腸癌CCL224侵襲與遷移能力產(chǎn)生影響，自噬上調(diào)組大腸癌細(xì)胞遷移能力最

7、強(qiáng)，自噬下調(diào)組遷移能力最弱，在侵襲實(shí)驗(yàn)中，自噬上調(diào)組穿出細(xì)胞數(shù)最多，而自噬下調(diào)組穿出細(xì)胞數(shù)最少;經(jīng)不同劑量照射后CCL224細(xì)胞與不同自噬狀態(tài)CAFs共培養(yǎng)，克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示自噬上調(diào)組克隆形成數(shù)最多，自噬下調(diào)組克隆數(shù)最少;4Gy照射后，對照組大腸癌細(xì)胞凋亡率為36.62％，自噬上調(diào)組的細(xì)胞凋亡率為21.56％，與其他兩種具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，而自噬下調(diào)組腫瘤細(xì)胞凋亡率為47.47％，與其他兩組具有顯著性差異(p＜0.01);γ

8、H2AX焦點(diǎn)計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)照射后4h及16h時(shí)，自噬下調(diào)組焦點(diǎn)計(jì)數(shù)明顯多于其他兩組;CAFs自噬改變，對凋亡相關(guān)基因的表達(dá)也產(chǎn)生顯著影響，自噬上調(diào)組的Bcl-2、NFκB基因表達(dá)上調(diào)，而Bax、P53及caspase-3表達(dá)下調(diào)，自噬下調(diào)組為Bcl-2與NFκB表達(dá)下調(diào)，而Bax、P53、caspase-3表達(dá)上調(diào);不同自噬水平CAFs的培養(yǎng)液中，乳酸含量明顯不同，以自噬上調(diào)組濃度最高，自噬下調(diào)組濃度最低;（三）1×106個(gè)HCT116及

9、CCL224細(xì)胞單獨(dú)接種，小鼠成瘤率極低，而與CAFs混合接種后全部小鼠成瘤，不受CAFs自噬狀態(tài)影響;CAFs自噬未調(diào)控組腫瘤體積最大、瘤體最重，自噬上調(diào)組Ki67表達(dá)最強(qiáng)，而自噬下調(diào)組腫瘤最小，瘤體最輕，Ki67、α-SMA及Glut-1表達(dá)最少，HCT116細(xì)胞移植瘤與CCL224細(xì)胞移植瘤中，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)缺乏一致性，自噬上調(diào)似可增加組織Beclin-1與caspase-3的表達(dá)。
　　結(jié)論:直腸癌直接原代培養(yǎng)法或利用原

10、代培養(yǎng)CNFs與腫瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)的活化誘導(dǎo)法，均可獲取具有典型表型與特征的CAFs，CAFs比CNFs具有更高的自噬水平;上調(diào)CAFs自噬水平，可降低共培養(yǎng)大腸癌細(xì)胞的放射敏感性，而抑制CAFs自噬，可增加共培養(yǎng)大腸癌細(xì)胞的放射敏感性;CAFs自噬調(diào)控對大腸癌放射敏感性的改變，可能與乳酸含量、促增殖/凋亡相關(guān)基因表達(dá)以及DNA損傷修復(fù)能力的變化有關(guān)。無論是否接受自噬調(diào)控預(yù)處理，CAFs均具有明顯促腫瘤成瘤作用。CAFs自噬，可能是腫瘤放