Apelin促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化的分子影像研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　缺血性血管疾病是目前威脅人類健康的重要疾病，其中促進(jìn)血管再生是目前治療缺血性疾病的主要方向。在眾多促進(jìn)血管再生的治療方法中，干細(xì)胞治療缺血性疾病成為了近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。然而，很多研究包括我們以往的研究結(jié)果顯示，成體干細(xì)胞尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞在移植后的存活數(shù)量較少而難以發(fā)揮長(zhǎng)期的治療作用。因此，如何促進(jìn)成體干細(xì)胞在體內(nèi)缺血部位的存活、整合、增殖并分化依舊是干細(xì)胞治療研究的難點(diǎn)。
　　Apelin是新發(fā)現(xiàn)的一

2、種小分子活性肽，是血管緊張素受體-1相關(guān)受體蛋白(putativereceptorproteinrelatedtotheangiotensinreceptorAT1，APJ)的內(nèi)源性配體。具有重要的心血管調(diào)節(jié)功能：舒張血管、降低血壓、保護(hù)心肌受損、增強(qiáng)心肌收縮力、拮抗血管緊張素Ⅱ?qū)π难芟到y(tǒng)的不良作用。同時(shí)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。
　　本實(shí)驗(yàn)將在我們以往研究的基礎(chǔ)上，利用分子影像學(xué)等手段，觀察Apelin對(duì)于間充質(zhì)干

3、細(xì)胞在缺氧條件下對(duì)細(xì)胞增殖所產(chǎn)生的影響以及Apelin對(duì)于干細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制，并為下一步成體干細(xì)胞治療的長(zhǎng)期獲益和不良影響進(jìn)行可靠評(píng)估。
　　方法：
　　第一部分：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定：用酶消化法分離?-actin-lucFVB轉(zhuǎn)基因小鼠的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（AD-MSCs），流式細(xì)胞術(shù)鑒定干細(xì)胞標(biāo)志，生物發(fā)光成像確定細(xì)胞熒光素酶（Fluc）的表達(dá)。
　　第二部分：不同濃度的Apelin對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的脂

4、肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、凋亡的影響：建立缺氧（H）6h/復(fù)氧（R）2h細(xì)胞模型，分3組：①空白對(duì)照組；②缺氧/復(fù)氧組（H/R）；③H/R＋Apelin干預(yù)組(10-10-10-5mol/L)。MTT法和生物發(fā)光成像（BLI）測(cè)定各組細(xì)胞增殖率，TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　第三部分：Apelin對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在后肢缺血小鼠體內(nèi)的作用:實(shí)驗(yàn)共分四組：假手術(shù)+AD-MSCs組、假手術(shù)+AD-MSCs+Apelin組、缺血+AD-MSC

5、s組、缺血+AD-MSCs+Apelin組。酶消化法培養(yǎng)小鼠AD-MSCs，建立后肢缺血模型，在模型后肢缺血部位按分組注射AD-MSCs(1×106)或AD-MSCs+Apelin。生物發(fā)光成像檢測(cè)細(xì)胞活性。
　　第四部分：Apelin影響小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、凋亡的機(jī)制：建立缺氧（H）6h/復(fù)氧（R）2h細(xì)胞模型，分3組：①空白對(duì)照組；②1×10-6mol/LApelin組；③Apelin+拮抗劑LY294002組（1×10

6、-6mol/LApelin+20μmol/LLY294002）。免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)激酶磷酸化Akt的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1．流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD44及CD90，而且熒光素酶（Fluc）的表達(dá)與細(xì)胞數(shù)量呈線性相關(guān)。
　　2.在缺氧環(huán)境中，Apelin的干預(yù)可顯著增加AD-MSCs的增殖，抑制凋亡。
　　3.Apelin可促進(jìn)后肢缺血模型中AD-MSCs的存活。
　　4.Wester